血管内皮生长因子和性别决定区Y框蛋白2在胃癌中的表达及与预后的关系

赵璐，杜小明

胃癌是全球发病率及死亡率较高的消化系统恶性肿瘤［1］，其中有约30%的病例发生在中国，而且中国每年有约10万人死于胃癌［2］。虽然D2根治性手术及术后辅助化疗显著提高了胃癌病人的5年生存率，但是对于局部晚期胃癌以及出现复发转移后的胃癌，当前的内科治疗疗效尚不理想。胃癌是一种异质性恶性肿瘤，这是其在相同临床分期病人中预后不同以及对标准治疗反应不同的主要原因，而基因组的复杂性和异质性是决定临床预后的肿瘤表型特征的根本原因［3］。因此，了解胃癌的分子和遗传特征对胃癌的有效和个性化管理至关重要。文献显示肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）的自我更新及异常分化在恶性肿瘤的演变过程中扮演决定性角色，并且肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展、转移及耐药等方面起重要作用［4-5］。肿瘤干细胞的自我更新及分化可以通过内在通路及来自肿瘤微环境的细胞因子调节，例如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及性别决定区Y框蛋白2（SOX2，sex-determining region Y-box 2，SOX2）等。与大家熟知的胃癌治疗靶点人表皮生长因子受体-2（HER-2）相比，VEGF与胃癌的研究近期才逐渐被报道，贝伐珠单抗和阿帕替尼联合化疗可能提升治疗疗效，但优势甚微［6-8］，而近期有研究显示SOX2是胃癌预后独立因子［9］。因此，对于肿瘤靶向治疗，研究这些调节CSCs的细胞因子则具有重要的意义。目前在肿瘤组织中同时检测VEGF及SOX2的表达及其与临床病理特征及病人预后的关系研究较少，而在胃癌中两者的研究更是没有。本研究同时检测VEGF及SOX2的蛋白表达水平及与临床病理特征和胃癌病人预后的关联，为后期研究VEGF及SOX2对胃癌病人预后起到的作用提供初步实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年3月至2017年12月皖北煤电集团总医院理科存档的胃癌手术标本40例。术前未接受放、化疗，临床病历资料完整。年龄范围为42～70岁，中位年龄58岁。男28例，女12例。根据第七版UICC/AJCC胃癌分期标准，临床分期为Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期24例。依据2016年WHO诊断标准，病例分级为高分化9例，中分化12例，低分化19例。肿瘤侵犯固有肌层及以上18例，肿瘤侵犯浆膜层及以下共22例。有淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者17例。40例病例均获得随访资料，随访时间12～60个月，癌旁组织32例，取自胃癌切除或胃镜活检病人。

1.2 试剂 兔抗人单克隆VEGF抗体（NeoMarkers公司，工作液稀释度1∶75），SOX2兔抗人多克隆抗体（NeoMarkers公司，工作液稀释度1∶75），中性甲醛固定液、乙醇、二甲苯、枸橼酸盐、Z中性树胶及过氧化氢均为国产产品，EnVision试剂盒购自于丹麦Dako公司，DAB显色液均由实验人员自行配制，购自上海睿铂赛生物科技有限公司的Envision试剂盒（DAB+CHROMOGEN C试剂液和SUBSTRATE BUFFERB试剂液），按1∶100的稀释度配置DAB显色溶液。

1.3 实验方法 免疫组织化学采用EnVision法。（1）首先标记切片；（2）然后放入65℃烤箱，将烤好的切片依次轻放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中；（3）然后将脱蜡后的切片按顺序浸入装有梯度乙醇溶液的液缸中；（4）采用微波修复方法，将切片放入微波炉中高火加热15 min；（5）将修复完的切片浸入新配制的3%甲醇双氧水溶液中；（6）切片用PBS缓冲液震洗三次，将切片放入双氧水中，室温下孵育10 min；（7）每张切片滴加已稀释至最佳工作浓度的一抗各160μL，然后4℃冰箱孵育过夜；（8）次日每张切片均滴加二抗各160μL，放入37℃恒温箱，孵育30 min；（9）每张切片的组织部位滴加DAB显色液100μL，显微镜下观察组织显色情况，显色完成后迅速用自来水冲洗；（10）切片放入苏木素染液缸中复染，盐酸乙醇浸洗，再放入乙醇中脱水，最后放入二甲苯中，取出后中性树胶封片。

1.4 结果判定 VEGF主要定位于细胞质，少数伴细胞核着色；SOX2主要定位于细胞核，部分伴有胞质及胞膜着色，染色阳性结果判断标准如下［10-11］：（1）阳性细胞率：＜5%计0分，6%～25%计1分，26～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分；（2）染色强度：无色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。由两项积分相加进行评分，两者乘积＜2分为阴性表达（-），＞2分为阳性表达（+）。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0进行统计分析。计数资料采用χ2检验（当所有例数≥5时，用Pearsonχ2检验，若所得P≈0.05时，用Fisher精确检验，当1≤例数＜5时，用连续校正χ2检验），两种蛋白之间的相关性检验采用Spearman秩相关分析，生存分析应用Kaplan-Meier法，用Long-rank检验进行多组比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF和SOX2在胃癌组织和胃癌癌旁正常组织中的表达 如图1所示，VEGF蛋白多定位于胃癌癌细胞的细胞质，少数定位于细胞膜，SOX2蛋白多数定位于胃癌癌细胞的细胞核，VEGF和SOX2在胃癌组织中的表达率分别为70.0%（28/40）和65.0%（26/40），与癌旁正常组织相比，二者表达差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 胃癌手术标本40例中胃癌组织与癌旁正常组织血管内皮生长因子（VEGF）及性别决定区Y框蛋白2（SOX2）表达比较

2.2 VEGF和SOX2的表达与胃癌临床病理参数的关系 在胃癌淋巴结转移（+）病人中，VEGF和SOX2蛋白阳性表达显著高于无淋巴结转移（-）病人，差异有统计学意义（P＜0.05）；在胃癌分期Ⅲ～Ⅳ期的病人中，VEGF和SOX2蛋白阳性表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期病人，差异有统计学意义（P＜0.05）；在T3～4及低分化病人中，VEGF蛋白阳性表达较T1-2及高分化病人显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），而SOX2蛋白阳性表达则差异无统计学意义；胃癌组织中，VEGF和SOX2的阳性表达与病人的年龄性别未见明显关联（表2）。

表2 胃癌病人血管内皮生长因子（VEGF）及性别决定区Y框蛋白2（SOX2）表达与临床病理系数关系

2.3 胃癌组织中VEGF和SOX2的表达的相关性在胃癌组织中，VEGF与SOX2的表达呈正相关关系（rs＝0.375，P＝0.017），见表3。

2.4 VEGF和SOX2的表达与胃癌病人预后的关系 生存分析结果显示，VEGF阳性表达组中中位OS（50%的个体存活时间）为28个月（95%CI：21～35个月），而VEGF阴性表达组中中位OS显著高于VEGF阳性表达组，差异有统计学意义（P＝0.001）（图2A）。SOX2阳性表达组中中位OS为28个月（95%CI：22个月～34个月），与阴性组者40个月（95%CI：23个月～57个月）相比明显减少，差异有统计学意义（P＝0.040）（图2B）。VEGF、SOX2同时阳性表达组中中位OS为28个月（95%CI：22个月～34个月），与同时阴性表达者中位OS及VEGF或SOX2仅1种表达者中位OS：37个月（95%CI：21个月～53个月）相比减少明显，差异有统计学意义（P＝0.010）（图2C）。

表3 胃癌组织中血管内皮生长因子（VEGF）与性别决定区Y框蛋白2（SOX2）表达的相关性

图2 血管内皮生长因子（VEGF）及性别决定区Y框蛋白2（SOX2）表达与胃癌病人生存预后关系：A为VEGF表达阳性和阴性与胃癌病人预后关系，B为SOX2表达阳性和阴性与胃癌病人预后关系，C为VEGF及SOX2两者不同表达状态下与胃癌病人预后关系

3 讨论

我国胃癌的总体5年生存率为30%～50%，其中一线治疗失败者对二线治疗如果始终有反应，则生存时间长于对二线化疗无反应者，但有接近40%的一线治疗后病情进展的病人对二线化疗无反应［10］。所以近年来对胃癌新靶点药物的研究日渐增多，目前NCCN已推荐对于不可手术的局部晚期、复发或转移性胃/胃食管结合部腺癌病人，如HER-2过表达，曲妥珠单抗联合化疗可作为一线治疗［11］。其他如EGF/EGFR、VEGF/VEGFR、ALK、MET和m-TOR等分子和信号通路被研究的最多。而其中VEGF不仅在肿瘤血管生成过程中起最关键的作用，而且还可以刺激包括造血干细胞、神经干细胞、内皮细胞等多种干细胞自我更新［12］。新的研究显示在胶质瘤及皮肤癌中，VEGF可以维持CSCs的干细胞状态［13］。SOX2基因位于3q26.33，编码317氨基酸转录因子，包含HMG域，可以调节胚胎干细胞的自我更新及分化，及维持体细胞向多潜能干细胞方向分化［14］，研究显示SOX2在乳腺癌、胃癌、肺癌及卵巢癌中的CSCs中高表达，并且可以维持CSCs的干细胞状态，提示SOX2在这些癌症的发生、发展过程中起重要作用［15-17］。Zhao等［18］和Kim等［19］研究显示在肺癌细胞及乳腺癌细胞中，VEGF可以通过VEGFR-2/Stat3信号通路诱导SOX2从而抑制miR-452和驱动Slug，进而维持肿瘤干细胞的自我更新和转移，提示VEGF和SOX2可能在肺上皮及乳腺上皮的癌变过程中起关键角色。且本课题组研究结果显示VEGF及SOX2的高表达可能提示肺鳞癌病人有着较差的预后［20］。而此次为了研究VEGF和SOX2对胃癌发生转移及预后的作用，本课题组观察了VEGF及SOX2在胃癌和癌旁正常组织的表达情况，并用统计学方法分析VEGF和SOX2蛋白的表达与临床参数的关系以及与胃癌病人预后的关联。

本研究结果表明VEGF在胃癌组织明显高表达，VEGF的高表达可能促进胃癌的淋巴结转移、出现更差的分化、更易出现血行转移及预示更晚的临床分期，生存分析回示VEGF预示着胃癌病人有着更差的预后。本研究结果与前期发表的VEGF和胃癌的研究结果相似，Chen等［21］及Pang等［22］的研究显示VEGF的表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移呈显著正相关。生存分析显示，高VEGF表达与胃癌病人预后不良有显著相关性，且VEGF表达是胃癌病人总生存率的独立预后参数，甚至可能为胃癌的诊断提供了新的线索。近年来对CSCs的基础研究和转化研究进展迅速，研究表明SOX2表达测定可作为胃CSCs分离鉴定的标志物，但是SOX2表达与病理参数和病人生存的关系仍存在争议，早年间SOX2被报道为一种肿瘤抑制因子通过调节细胞周期蛋白D1、磷酸化Rb或p27水平从而抑制细胞生长，此外，SOX2已经被证明可以抑制迁移p21表达上调对胃癌的侵袭作用。但近年来越来越多的研究表明SOX2在胃癌的发生发展中起致癌基因的作用，抑制SOX2的表达可减少胃癌细胞的增殖、迁移和致瘤潜能，并破坏肿瘤干细胞样表型［23-25］。这和我们的研究结果相似，SOX2在胃癌中的高表达，可能促进胃癌病人淋巴结转移及提示这些病人的临床分期较晚，且SOX2的高表达预示着这些病人有着更差的预后。

迄今，关于VEGF和SOX2在肿瘤中的研究较少，文献报道二者在肿瘤中联系可能由下列两种机制所致：（1）VEGF通过VEGF受体-2（VEGFR-2）/stat3介导的Myc和SOX2的上调促进乳腺癌和肺癌干细胞（CSC）的自我更新，VEGF高表达的肿瘤最有可能通过上调VEGF逃避抗血管生成药物，促使CSC自我更新，在治疗后重新增殖。（2）VEGFA诱导SOX2表达可促进EMT和肿瘤转移。在乳腺癌细胞系和原发性肿瘤培养中，VEGFA快速上调SOX2表达，导致SNAI2诱导、EMT、侵袭转移增加。除了血管生成作用外，VEGFA还上调SOX2来驱动干细胞扩增，同时miR-452缺失和Slug上调，为肿瘤干细胞获得转移潜能提供了一种新的机制［18-19］。而我们的研究结果显示，胃癌组织中VEGF与SOX2的表达呈正相关关系，这一结果与上述报道细胞水平研究结果相一致，并且生存分析显示VEGF和SOX2同时高表达的病人与仅一种表达或都不表达的病人相比生存时间明显降低，而且单因素分析结果显示VEGF与SOX2的单独高表达提示这些胃癌预后较差。但是这一结果仍需要后期加大样本量和减少生存分析删失数目的研究来进一步验证。

综上所述，VEGF和SOX2在胃癌的癌变进展演变中扮演重要角色，同时可能存在着VEGF-VEGFR-2/JAK2/STAT3-SOX2这一信号轴，做为胃癌后期靶向治疗研究方向。而且迄今为止，抗VEGF在肿瘤靶向治疗中取得的成功有限，考虑与抗血管生成药物导致肿瘤缺氧，进而导致VEGF和CSC均上调相关。我们希望将VEGF与肿瘤的发生和转移潜能的获得联系起来的机制见解，最终为VEGF通路靶向研究产生新的策略。

（本文图1见插图4-4）

图1 血管内皮生长因子（VEGF）及性别决定区Y框蛋白2（SOX2）在胃癌及癌旁正常组织的表达情况：A为VEGF在胃癌组织的表达情况，B为VEGF在癌旁正常组织的表达情况，C为SOX2在胃癌组织的表达情况，D为SOX2在癌旁正常组织的表达情况