草莓抗白粉病RPW8 同源基因的序列特征分析

高凤菊，张淑红，张运峰，宋瑞生，韩靖玲，刘海英

（1. 唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000；2. 唐山市农业科学研究院，河北 唐山 063000）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）为蔷薇科草莓属多年生草本植物，含有丰富的维生素、胡萝卜素、苹果酸、叶酸、铁、钙等营养物质，具有维护上皮组织健康、明目养肝、促进食物消化和生长发育等功效。草莓适合采摘、鲜食，也可以加工生产饮料，具有很高的营养价值和经济价值，已成为世界广泛栽培的经济作物之一。草莓喜光、喜水，但不耐涝，不耐盐碱，在栽培过程中极易产生病害问题。草莓白粉病是世界上草莓产区普遍发生的一种病害，主要危害叶片、叶柄、花、花梗和果实，严重时整个叶片枯黄、花蕾不能开放、幼果不能正常膨大，在设施栽培过程中极易流行，造成严重的经济损失[1-5]。在生产上主要采用化学防治，但由于防治白粉病的药剂品种较少，防治效果受施药时期和环境条件影响较大，且因抗药性增强加大药量易产生药害等因素，使化学防治方法受到很大的限制。采用抗病品种是解决该问题的最佳途径之一，而选育抗病品种离不开抗病基因的筛选和鉴定[6-8]。

RPW8（Resistance to powdery mildew 8）是在拟南芥上发现的具有白粉病抗性的重要抗病基因，分为RPW8.1 和RPW8.2 两种类型[9]。RPW8.1和RPW8.2 在拟南芥Ms-0 生态型里紧密连锁，并且主要存在于抗白粉病的拟南芥生态型中，而感病的拟南芥生态型中则缺乏这2 个基因[10]。研究发现，RPW8 基因对拟南芥霜霉菌和烟草花叶病毒等也表现出较高的抗性，具有广谱抗病性[11,12]，是抗病育种的最佳抗病基因来源。本文利用草莓基因组数据，鉴定出15 个草莓RPW8 同源基因，在进行序列分析的基础上，对其结构和功能进行分析预测，为草莓抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 草莓RPW8 同源基因的获得

草莓基因组和蛋白质数据下载于JGI（Joint Genome Institute）的Phytozome 数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov）。利用 Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org）检索拟南芥的RPW8 基因，以拟南芥的RPW8.1 和RPW8.2 的氨基酸序列对草莓的蛋白质数据库进行Blastp 比对，获得与拟南芥RPW8.1 和RPW8.2 高度同源的草莓RPW8同源基因。

1.2 草莓RPW8 同源基因的序列特征分析

利用PFAM 数据库（http://pfam.xfam.org/）对草莓RPW8 同源基因进行结构域分析，分析其可能功能，利用在线分析软件 SMS（Sequence manipulation suite，http://www.bioinformatics.org/sms2/dna_stats.html）对RPW8 基因家族的核酸特征进行分析，利用在线软件 ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析RPW8 基因家族氨基酸的理化性质。

1.3 草莓RPW8 基因的系统进化分析

利用 Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）获得番茄、谷子、小麦等其它植物的RPW8同源基因的氨基酸序列，利用Mega 7.0.4 软件对草莓及其它植物的RPW8 同源基因进行氨基酸序列的比对和系统进化分析，建立系统进化树，通过同源性比较确定草莓RPW8 基因的类型。Align选用Muscle，Phylogeny 选用Maximum Parsimony，校验参数BootStrap 重复为1 000 次，其他参数均为默认值。

2 结果和分析

2.1 草莓RPW8 同源基因的获得

通过对草莓蛋白质数据库进行Blastp 比对，获得了1 个拟南芥RPW8.1 草莓同源基因：mrna 27107.1-v1.0-hybrid（score 35.4，E-value 3.3 E-3，LG5:23 157 394-23 157 774 reverse），并命名为FaRPW8.1；获得了14 个拟南芥RPW8.2 的草莓同源基因，分别命名为FaRPW8.2-1～14，见表1。

表1 草莓的拟南芥RPW8.2 同源基因

分析这15 个草莓RPW8 同源基因在染色体上 的位置，发现FaRPW8.2-12 和FaRPW8.2-13 与FaRPW8.1 在同一条染色体 LG5 并相邻，FaRPW8.2-6、FaRPW8.2-8 和FaRPW8.2-14 分别位于LG1、LG4 和LG3，FaRPW8.2-4 在未定位染色体上，其余8 个同源基因都位于LG6 染色体的相邻位置上。

2.2 草莓RPW8 同源基因编码蛋白的结构域分析

分析草莓RPW8 同源基因的PFAM 结构域，结果见图1。

从图1 可以看出，草莓RPW8 同源基因编码的蛋白含有1～4 个结构域，其中RPW8 为特征结构域，存在于所有蛋白序列中。FaRPW8.1 为单结构域蛋白，只有1 个RPW8；FaRPW8.2-2～9 和FaRPW8.2-11～13 等11 个草莓RPW8 同源基因为双结构域蛋白，除了含有一个RPW8 外，还包括另一个RPW8、NB-ARC 或Protein tyrosine kinase结构；FaRPW8.2-1 和FaRPW8.2-14 为三结构域，均含有RPW8 和NB-ARC，另外分别含有一个Ulp1 protease 和Ring finger domain；FaRPW8.2-10 为四结构域，含有2 个RPW8、1 个NB-ARC 和1 个AAA domain。

图1 草莓RPW8 同源基因编码蛋白的结构域分析

2.3 核酸序列特征分析

利用SMS 分析草莓RPW8 同源基因的核苷酸序列特征，结果显示各碱基的比例相差较小，其中基因FaRPW8.2-6 的碱基G+C 含量最低为40.77%，而碱基A+T 的含量最高为59.22%。基因FaRPW8.1 的碱基G+C 含量最高为45.93%，而碱基A+T 的含量最低为54.06%（见表2）。

表2 草莓同源基因的核酸特征分析

2.4 氨基酸序列特征分析

草莓RPW8 同源基因编码蛋白间的相对分子量相差较大，最小的是FaRPW8.1（14 734.2 Da），最大的是FaRPW8.2-10（196 956.9 Da）；理论等电点范围为5.05～8.52；FaRPW8.2-10 带的负电荷和正电荷氨基酸数量均最高，分别为225 和200，FaRPW8.1 带负电荷和正电荷氨基酸数量均最低，分别为19 和21；蛋白质不稳定性指数为39.35～53.50，最低为FaRPW8.2-2，最高为FaRPW8.2-1；脂肪族指数93.19～108.68 之间；氨基酸组成成分以亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）为主，Leu 含量最高，平均为13.92%，其次为Lys，平均为8.08%（表3）。

表3 草莓同源基因的氨基酸特征分析

2.5 系统进化分析

利用Mega 软件建立草莓及拟南芥、谷子、番茄等植物的系统进化树，结果见图2。

从图2 可知，草莓RPW8 同源基因可以分为三类：A 类为FaRPW8.2-3 与番茄、蜜柑、橙子等RPW8 同源基因，但同源性较低；B 类全部为草莓RPW8 同源基因，包括FaRPW8.1、FaRPW8.2-1～2、FaRPW8.2-3～11 和FaRPW8.2-14 等12 个草莓RPW8 同源基因；C 类包括 FaRPW8.2-12 和FaRPW8.2-13 及谷子、小麦、水稻的RPW8 同源基因遗传距离较小。

3 讨论和结论

图2 草莓RPW8 同源基因的系统进化树

基于草莓基因组获得了15 个草莓的RPW8 同源基因，在数量上多于拟南芥（6 个）、油菜（7个）、桃子（12 个）和梨（12 个），略低于杏[9,11,13]（16 个），说明RPW8 基因在草莓基因组有所扩展，说明草莓基因组中具有较深厚的白粉病抗性潜力，如果加以合理利用，将对草莓的抗病育种有很大贡献。

草莓RPW8 同源基因主要位于LG5 和LG6 染色体，仅有个别基因位于其它染色体上，说明在进化上可能由于基因重复、插入、缺失、交换等事件的发生，使RPW8 基因得以扩增并发生了序列上的变化。草莓的RPW8 同源基因G+C 含量（平均 42.3%）低于 A+T 含量（平均 57.6%），(A+T)/(G+C)为1.36，该研究结果与杏RPW8 同源基因相似[11][G+C 含量41.1%，A+T 含量58.8%，(A+T)/(G+C)为 1.43]，推测(A+T)/(G+C)可能为RPW8 基因的核酸序列重要特征之一。

草莓RPW8 同源基因的编码蛋白间的分子量、理论等电点和不稳定指数差异较大，但都以亮氨酸和赖氨酸的含量最丰富，这主要与RPW8 基因含有NB-LRR 结构有关。NB-LRR 类蛋白是植物体内发现的最庞大的一类抗病蛋白，它们包含N端的核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domain，NB）和C-端的富含亮氨酸重复（leucinerich repeat，LRR）结构域[14]。LRR 结构域主要参与无毒基因产物与抗病蛋白的识别和结合，并诱导寄主植物产生一系列的抗病反应[15]。草莓RPW8同源基因编码蛋白的结构域分析结果也证明了这一点，在15 个草莓RPW8 同源基因中有11 个基因都存在NB-LRR 结构域。

系统进化分析中，除了FaRPW8.2-3、FaRPW 8.2-12 和FaRPW8.2-13 与番茄、谷子、小麦等植物的RPW8 同源基因有较高的同源性以外，其它12 个草莓RPW8 同源基因聚为一类，推测草莓RPW8 同源基因在进化过程中产生了分化，形成了某些特有的功能特点。