镰叶西番莲地上部分水提取物对乙醇诱导小鼠急性肝损伤的保护作用研究

卢传礼

〔1. 广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)， 广东 广州 510316； 2. 中国科学院西双版纳热带植物园， 云南 西双版纳 666303〕

随着经济的发展，中国酒精性肝病的发病率呈逐年上升的趋势，目前，已成为仅次于传染性肝病的第2大类肝病[1]，因此，寻找防治酒精性肝病的有效药物具有重要的临床和社会意义。

镰叶西番莲(PassiflorawilsoniiHemsl.)隶属于西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(PassifloraLinn.)，分布于中国云南以及缅甸、泰国、老挝和越南等国家[2]，其地上部分又名锅铲叶，为中国西南地区少数民族的常用药物，常与其他药材配伍用于治疗急性黄疸型肝炎、肝硬化、肝炎和肝硬化腹水等肝脏疾病[3-7]。镰叶西番莲含有三萜、甾醇和黄酮类成分[8-10]。目前，关于镰叶西番莲有效成分及生理活性的报道较少。本研究首次运用乙醇诱导的小鼠急性肝损伤模型对镰叶西番莲的护肝效果进行评价，以期为镰叶西番莲的传统临床应用提供科学依据，并为防治酒精性肝病开拓新资源。

1 材料和方法

1.1 材料

供试镰叶西番莲地上部分于2017年10月采自云南省西双版纳傣族自治州勐遮镇，经中国科学院西双版纳热带植物园肖春芬高级实验师鉴定。凭证标本(HITBC091711)保存于中国科学院西双版纳热带植物园植物标本馆(HITBC)。

供试4周龄雄性NIH小鼠(18～22 g)由广东省医学实验动物中心提供，合格证号SCXK(粤)2013-0002，伦理委员会编号XTBG 2017-07-001。饲养室温度20 ℃～24 ℃，空气相对湿度30%～70%。

联苯双酯滴丸(批号NF4006)购自广州白云山星群(药业)股份有限公司；无水乙醇(优级纯)购自广东光华科技股份有限公司；血清中谷丙转氨酶活性(批号20170122)、谷草转氨酶活性(批号20170212)、甘油三酸酯含量(批号20171218)和总胆固醇含量(批号20161222)以及肝脏组织中甘油三酸酯含量(批号20171228)的ELISA检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司；血清中极低密度脂蛋白含量(批号20170725)以及肝脏组织中丙二醛含量(批号20170712)和超氧化物歧化酶活性(批号20170713)的ELISA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；羧甲基纤维素钠(批号160072311)购自上海申光食用化学品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 镰叶西番莲地上部分水提取物(WEPW)的制备 新鲜镰叶西番莲地上部分经45 ℃鼓风干燥，粉碎后过60目筛。取150 g粉末，加入1.5 L自来水加热回流提取1.5 h，纱布过滤后收集滤液，滤渣用上述方法重复提取2次。合并3次滤液，减压浓缩至约100 mL，冷冻干燥后得到WEPW 12.3 g。

1.2.2 动物分组、造模和给药 将60只小鼠适应性饲养1周后，按照体质量随机分为6组，每组10只。正常组(Ⅰ)和乙醇诱导急性肝损伤模型组(Ⅱ)小鼠以20 mL·kg-1·d-1剂量灌胃给予质量体积分数0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，阳性对照组(Ⅲ)小鼠灌胃给予联苯双酯-质量体积分数0.5% CMC-Na溶液(联苯双酯剂量为200 mg·kg-1·d-1)，WEPW的低剂量组(Ⅳ)、中剂量组(Ⅴ)和高剂量组(Ⅵ)小鼠分别灌胃给予不同浓度WEPW-质量体积分数0.5% CMC-Na溶液(WEPW剂量分别为100、200和400 mg·kg-1·d-1)。每天1次，持续7 d。从第5天开始，给药4 h后，除Ⅰ组外，其他5组以12 mL·kg-1·d-1剂量灌胃给予体积分数50%乙醇溶液，建立乙醇诱导小鼠急性肝损伤。记录实验开始和结束时小鼠的体质量。末次给予体积分数50%乙醇溶液后禁食不禁水16 h，眼眶取血，于4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，-20 ℃保存、备用。取血完毕后处死小鼠，称量肝脏质量。然后取部分肝脏组织，-80 ℃保存、备用，另取一部分肝脏组织进行病理学检测。

1.2.3 血清相关指标检测 按照试剂盒说明书进行实验操作，利用Varioskan©Flash酶标仪(美国Thermo Scientific公司)测定波长510 nm处的吸光度值，计算血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性以及甘油三酸酯和总胆固醇的含量，测定波长450 nm处的吸光度值，计算血清中极低密度脂蛋白含量。

1.2.4 肝脏相关指标检测 取部分肝脏组织剪碎，加入9倍质量0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，充分匀浆后，于4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min，取上清液。按照试剂盒说明书检测肝脏组织中甘油三酸酯含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。按照公式“肝脏指数=(肝脏质量/实验结束时体质量)×100%”计算肝脏指数。

1.2.5 肝脏组织病理学检查 取部分肝脏组织，冷冻后切片(5 μm)，加入油红O进行染色，在BX41光学显微镜(日本Olympus公司)下观察。

1.3 数据统计分析

采用PASW Statistics 18.0软件对实验数据进行统计分析，采用单因素方差分析进行显著性检验。

2 结果和讨论

镰叶西番莲地上部分水提取物(WEPW)对乙醇诱导急性肝损伤小鼠血清和肝脏相关指标的影响见表1，对其肝脏组织病理学的影响见图1。

2.1 对血清相关指标的影响

结果(表1)显示：与正常组相比较，乙醇诱导急性肝损伤模型组小鼠血清中谷丙转氨酶活性以及甘油三酸酯、总胆固醇和极低密度脂蛋白的含量分别显著或极显著升高2.8、2.6、1.6和10.4倍，但谷草转氨酶活性无显著变化，表明乙醇诱导急性肝损伤模型造模成功。与乙醇诱导急性肝损伤模型组相比较，WEPW中剂量组和高剂量组小鼠血清中谷丙转氨酶活性和甘油三酸酯含量显著或极显著降低，WEPW高剂量组血清中极低密度脂蛋白浓度含量显著降低，但WEPW 3个剂量组均对血清中总胆固醇含量无显著影响，说明WEPW对乙醇诱导小鼠急性肝损伤有明显的预防作用。

组别Group血清相关指标 Related indexes of serum肝脏相关指标 Related indexes of liverALTASTTGTCVLDLLITGMDASODⅠ50.9±9.3155.5±26.31.13±0.304.53±0.540.17±0.104.36±0.230.42±0.050.53±0.19403.5±26.5Ⅱ142.0±24.2#213.9±40.22.89±0.90##7.26±1.26##1.76±0.44##6.81±0.41##0.97±0.27##1.54±0.34##236.3±26.6#Ⅲ35.8±16.0**152.3±44.91.12±0.34**6.96±1.490.38±0.22*5.46±0.39*0.46±0.08*0.69±0.24**377.2±28.9*Ⅳ96.8±22.3167.4±51.61.35±0.23*7.61±1.290.63±0.426.15±0.49*0.49±0.080.83±0.29269.1±54.6Ⅴ72.1±15.2*165.7±36.41.09±0.24**6.91±1.240.57±0.355.89±0.48*0.40±0.12**0.76±0.23*328.2±48.9*Ⅵ64.7±12.9*157.6±64.31.05±0.13**7.17±1.020.44±0.24*5.59±0.60*0.39±0.04**0.63±0.15*347.9±26.3*

1)Ⅰ： 正常组Normal group； Ⅱ： 乙醇诱导急性肝损伤模型组Ethanol-induced acute liver injury group； Ⅲ： 阳性对照组Positive control group； Ⅳ： WEPW低剂量组WEPW group at low dose； Ⅴ： WEPW中剂量组WEPW group at middle dose； Ⅵ： WEPW高剂量组WEPW group at high dose. ALT： 谷丙转氨酶活性Alanine aminotransferase activity (U·L-1)； AST： 谷草转氨酶活性Aspartate aminotransferase activity (U·L-1)； TG： 甘油三酸酯含量Triglyceride content (mmol·L-1)； TC： 总胆固醇含量Total cholesterol content (mmol·L-1)； VLDL： 极低密度脂蛋白含量Very low-density lipoprotein content (μmol·L-1)； LI： 肝脏指数Liver index (%)； MDA： 丙二醛含量Malondialdehyde content (nmol·mg-1)； SOD： 超氧化物歧化酶活性Superoxide dismutase activity (nmol·mg-1). #和##分别表示与Ⅰ组间存在显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)差异 # and ## respect significant (P<0.05) and obviously significant (P<0.01) differences with group Ⅰ， respectively. *和** 分别表示与Ⅱ组间存在显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)差异 * and**respect significant (P<0.05) and obviously significant (P<0.01) differences with group Ⅱ， respectively.

2.2 对肝脏相关指标的影响及病理学检查结果

结果(表1)显示：与正常组相比较，乙醇诱导急性肝损伤模型组小鼠的肝脏指数以及肝脏组织中甘油三酸酯和丙二醛的含量极显著升高，超氧化物歧化酶活性显著降低；与乙醇诱导急性肝损伤模型组相比较，WEPW中剂量组和高剂量组的肝脏指数以及肝脏组织中甘油三酸酯和丙二醛的含量显著或极显著降低，超氧化物歧化酶活性显著升高，且作用强度具有浓度依赖性，说明WEPW能够改善乙醇诱导的小鼠肝脏氧化应激状态。此外，肝脏组织病理切片(图1)显示：WEPW 3个剂量组能够有效改善乙醇诱导急性肝损伤小鼠肝脏组织脂滴积累的状况。

Ⅰ： 正常组Normal group； Ⅱ： 乙醇诱导急性肝损伤模型组Ethanol-induced acute liver injury group； Ⅲ： 阳性对照组Positive control group； Ⅳ： WEPW低剂量组WEPW group at low dose； Ⅴ： WEPW中剂量组WEPW group at middle dose； Ⅵ： WEPW高剂量组WEPW group at high dose.

图1 镰叶西番莲地上部分水提取物(WEPW)对乙醇诱导急性肝损伤小鼠肝脏组织病理学的影响

Fig. 1 Effects of water extract from above-ground part ofPassiflorawilsoniiHemsl. (WEPW) on liver histopathology of mice with ethanol-induced acute liver injury

山楂酸是一种天然的五环三萜类化合物，可有效减轻乙醇诱导的小鼠肝脏氧化和炎性损伤[11]，抑制高血糖引起的大鼠肝脏氧化损伤[12]，抑制四氯化碳诱导的肝细胞损伤[13]。镰叶西番莲含有山楂酸[8]，且作者测得WEPW中总三萜类含量高达247.97 mg·g-1(未发表数据)，推测山楂酸是锅铲叶保肝护肝的有效成分之一。

本研究首次证实了WEPW能够有效预防乙醇导致的小鼠急性肝损伤，并初步揭示其保肝护肝作用可能与改善肝脏的氧化应激状态有关，为其传统的保肝护肝功效应用提供了科学依据，但镰叶西番莲的临床疗效、药理活性、有效成分和作用机制等方面亟待进一步研究。