高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的疫苗破乳方法比较

徐 嫄，王 兆，朱元源，李 翠，邹兴启，朱利敏，万建青，王 琴，郎洪武，夏应菊，徐 璐，张乾义，赵启祖

(中国兽医药品监察所, 北京 100081)

口蹄疫(foot-and-mouth disesase,FMD)是一种由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disesase virus，FMDV)引起的可以对家畜造成非常严重经济损失的疫病，我国目前通过注射灭活疫苗来控制该病的流行。口蹄疫病毒完整病毒粒子在蔗糖密度梯度中的相对沉降系数为146S，分子量为8.08×106u，在酸性、碱性或一定温度条件下降解为12S和5S粒子，失去免疫原性[1]。因此口蹄疫灭活疫苗中146S抗原的含量直接关系到疫苗的免疫效果。已有研究表明，高效体积排阻色谱技术(High Performance Size Exclusion Chromatography，HPSEC)在口蹄疫灭活疫苗生产过程中，可应用于病毒颗粒的检测[2-4]。在前期的研究中，我们已经建立了口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的HPSEC检测法[5]，并开展优化研究，进一步提高了方法的准确性和可靠性[6]。该方法使用正戊醇对双相油乳剂口蹄疫灭活疫苗进行破乳，用核酸酶处理破乳得到的水相以去除干扰，最后通过HPSEC检测水相中的146S抗原。由于色谱检测的是疫苗破乳后的水相部分，因此破乳的可操作性和有效性，以及对保持破乳水相中146S抗原的稳定性都是至关重要的。前期试验中使用正戊醇对疫苗进行破乳，取得了良好的效果，但仍存在不同生产企业的疫苗破乳水相体积存在差异，操作方法较为复杂等问题。本研究分别使用正戊醇、正丁醇、三氯甲烷对9批2019年监督抽检的口蹄疫灭活疫苗样品进行破乳，通过比较破乳后水相体积和146S抗原HPSEC检测结果，评价最优的破乳方法，进一步提高146S抗原检测结果的准确性和方法的适用性。

1 材料与方法

1.1 仪器 2010A型高效液相色谱仪(岛津公司)，L203型电子天平(梅特勒-托利多)，CF16X型离心机(HITACHI)，纯水机(MiliQ)，生物安全柜(NUAIRE)，PHSJ-4F型pH计(雷磁)，单道移液器(eppendorf)，TS-1摇床(Qilinbeier)。

1.2 试剂与材料 无水硫酸钠、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、正戊醇、正丁醇、三氯甲烷、氯化钠，国药集团(分析纯)；Benzonase核酸酶，Sigma公司；口蹄疫灭活病毒颗粒(146S抗原)标准品由中国科学院过程工程研究所制备；9批口蹄疫灭活疫苗为中国兽医药品监察所2019年监督检验留样。

1.3 色谱条件 色谱柱：TSKgel G4000SWXL(7.8 mm×30 cm)色谱柱(TOSOH)；流动相：称取磷酸氢二钠15 g，磷酸二氢钠1.25 g，无水硫酸钠14.2 g，加水定容至1 L；紫外检测器检测波长：259 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：100 μL。

1.4 疫苗前处理 每批疫苗采用不同的有机试剂处理,分别重复3份。正戊醇和正丁醇前处理操作方法：取9 mL疫苗，1 mL正戊醇或正丁醇，加入15 mL离心管，上下剧烈振荡离心管5 min使疫苗破乳，4 ℃静置1 h使分层，将离心管置于冰上，缓慢吸取上层有机相弃去，缓慢吸取底层水相200 μL转入1.5 mL离心管，加入0.5 μL Benzonase核酸酶，吹打混匀，置摇床振摇，室温反应1 h。三氯甲烷前处理操作方法：取6 mL疫苗和6 mL三氯甲烷加入15 mL离心管，上下剧烈振荡离心管5 min使疫苗破乳，4 ℃ 4000 r/min离心10 min，缓慢吸取上层水相200 μL转入1.5 mL离心管，加入0.5 μL Benzonase核酸酶，吹打混匀，置摇床振摇，室温反应1 h。

2 结果与分析

2.1 线性回归方程 口蹄疫灭活病毒颗粒(146S抗原)标准品建立线性回归方程为y=64409x-80431，R2=0.9981，线性关系良好(图1)。

图1 口蹄疫灭活病毒颗粒146S标准曲线

2.2 破乳水相得率 使用正戊醇、正丁醇分别破乳疫苗静置分层后水相在底层，使用三氯甲烷破乳疫苗离心后水相在顶层，以1号疫苗为例分层结果见图2；9批疫苗的破乳水相得率见表1。

2.3 色谱结果 9批疫苗的色谱结果以三氯甲烷前处理后单次检测色谱图结果为例，见图3。

A.正戊醇；B. 正丁醇；C. 三氯甲烷A.n-amyl alcohol; B. n-butanol; C. trichloromethane

表1 9批疫苗三种前处理方法的破乳水相得率

图3 三氯甲烷前处理9批疫苗单次HPSEC检测色谱图

2.4 146S抗原含量检测结果 将146S峰面积代入线性回归方程计算得破乳水相中146S抗原含量，再乘以水相得率计算得疫苗中146S抗原含量(表2)。

表2 9批疫苗HPSEC检测结果

2.5 统计学分析结果 分别对三种不同前处理方法检测9批疫苗的均值应用SAS9.2软件作统计学分析，结果表明具有统计学意义(表3)；单因素方差分析表明，三种方法的检测结果无显著性差异(表4)。

表3 SAS9.2软件分析结果

表4 单因素方差分析结果

3 讨论与结论

在前期的实验室研究阶段，将口蹄疫抗原浓缩液用PBS稀释成不同浓度后，与ISA206油佐剂等体积混合，使用正戊醇对口蹄疫疫苗进行破乳，破乳水相得率为46%[5,7]。但在疫苗样品的检测中却发现，即使各生产企业均以等体积水相和有机相配苗，但并非每批疫苗都能达到46%的水相得率，因此检测过程中需要同时测量水相体积。另一方面，使用正戊醇破乳后，由于水相在底层，导致取样过程极易混入有机相。以上两方面因素不仅增加了操作难度，而且易导致油相进入色谱系统，影响检测结果的准确性。针对以上问题，我们对破乳方法进行了研究，通过比较正戊醇、正丁醇、三氯甲烷这三种破乳试剂在9批疫苗产品的146S含量检测中的破乳水相得率、检测结果的差异，以及可操作性，进行破乳方法的比较和优化。结果表明，使用三氯甲烷对9批疫苗破乳后得到的水相体积最大，并且数值稳定，9批疫苗水相得率均为50%；另外两种有机试剂的水相提取率则相对较低，且数值不稳定。应用SAS9.2软件对三组146S检测结果的分析表明，三组数据具有统计学意义；单因素方差分析表明，三组数据无显著性差异，其中三氯甲烷组和正戊醇组的结果一致性强，正丁醇组数据普遍偏低。使用三氯甲烷进行破乳时，可以通过离心处理加快分层速度，并且破乳后水相在上层，便于取样，降低了操作难度。正戊醇和正丁醇的使用量低于三氯甲烷，对相同体积的疫苗进行破乳处理，正戊醇和正丁醇仅需要疫苗体积的1/9，使用三氯甲烷则需要与疫苗体积相等才能达到有效破乳。但HPSEC检测具有样品用量少的优点，由于三氯甲烷前处理的破乳水相得率稳定，则不需要对样品进行大量破乳用以测量水相体积，从而避免三氯甲烷的大量使用。

综上所述，在应用HPSEC对口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原含量进行检测时，使用三氯甲烷对疫苗进行破乳，不仅检测结果准确，而且操作简便快速，是更为理想的破乳试剂。本实验通过对破乳方法的研究，改进了口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的HPSEC检测方法。应用HPSEC检测口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原含量，不仅符合动物实验3R原则，而且能够解决当前面临的检验用阴性动物供应困难、检验成本过高等问题。该方法有望成为效力检验的动物实验替代方法，为提高我国口蹄疫灭活疫苗的研制水平和疫病的防控提供有力技术支持。