20 307例黎族新生儿多种遗传代谢性疾病筛查研究

赵振东，王洁

遗传代谢性疾病又称为先天性代谢缺陷疾病（IEM），是指由于基因突变引起酶缺陷、细胞膜功能异常或受体缺陷，从而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一组疾病［1］。目前发现已有1 000多种，尽管遗传代谢性疾病单一病种发病率低，但因其疾病种类多，国外有数据表明，其综合发病率为1/2 555～1/784［2-4］，平均约为1/1 000［5］，累计发病率高。本研究借助海南省重大科技计划项目的研发以及中国出生缺陷基金会2017年8月在海南省开展多种遗传代谢性疾病免费筛查项目的实施，将20 307例黎族新生儿干血片样本进行串联质谱法筛查遗传代谢性疾病，从而在黎族人群中防治遗传代谢性疾病等出生缺陷性疾病，同时建立黎族生物样本库，现将筛查结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集海南省2016年10月—2018年9月出生的黎族新生儿共计20 307例，其中男婴10 254例，女婴10 053例。新生儿出生满3～28 d，采取知情同意原则，自愿参加免费的多种遗传代谢性疾病筛查。本研究经过海南省妇幼保健院伦理审查，批准号为海南省妇幼保健院（2018）伦审第（37）号。

1.2 样本采集 按照《新生儿筛查采血技术规范》［6］要求，使用新生儿筛查采血卡，采集出生满3～7 d，充分哺乳6～8次的新生儿足跟血。

1.3 样本要求 血斑直径≥8 mm，血斑数量3～4个，双面渗透均匀。阴凉处水平晾干，密封于封口袋2～8 ℃冰箱保存，5 d内新生儿筛查冷链系统送至海南省新生儿疾病筛查中心串联质谱实验室待检。

1.4 实验仪器和试剂 非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮串联质谱法测定试剂盒（美国PE公司）、ACQUITYTM型串联质谱仪（美国Waters公司）、艾本森MicBio-Ⅳ型孵育振荡器（合肥爱本森公司）、Vortex Mixer XW-80A混匀器（海门其林贝尔公司）以及打孔钳（芬兰PE公司，直径3 mm）。

本研究价值和提示：

（1）本研究在黎族新生儿中进行多种遗传代谢性疾病的筛查，这在海南省尚属首次。

（2）赵振东等在20 307例黎族新生儿群体中通过多种遗传代谢性疾病的筛查，发现了12例患儿，主要有原发肉碱缺乏症（PCD）、苯丙酮尿症（PKU）、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（MCCD）、丙二酸血症（MAD）和甲基丙二酸血症（MMA）5类疾病，在有限的黎族新生儿群体中得到了黎族人群遗传代谢性疾病发病率为59/10万，发现黎族人群遗传代谢性疾病发病率高。

1.5 方法

1.5.1 遗传代谢性疾病串联质谱初筛 严格按照试剂盒说明书进行实验操作，在新生儿干血片样本上，使用打孔钳打下直径为3 mm的血斑，使用试剂盒中配制试剂经孵育萃取后，上串联质谱仪检测样本中11种氨基酸、1种游离肉碱以及30种酰基肉碱，分析浓度和比值共计78项指标。

1.5.2 初筛遗传代谢性疾病异常结果确认 实验报告送至遗传代谢性疾病专科医生审核。根据“串联质谱扩大新生儿疾病筛查鉴定代谢性疾病的后续检测”召回和后续协议［7］，遗传代谢性疾病专科医生根据临床症状和实验数据进行判断。

1.5.3 遗传代谢性疾病基因诊断 经医生判断疑似遗传代谢性疾病的样本，召回重新采血外送北京迈基诺基因公司进行测序进行基因诊断。

2 结果

2.1 异常率 遗传代谢性疾病专科医生根据串联质谱78项实验室指标参考范围和临床症状进行判断初筛异常有840例，初筛异常率为4.14%（840/20 307）。随访死亡5例，召回835例，复查后排除770例，疑似遗传代谢性疾病65例，召回异常率7.78%（65/835）。在65例疑似遗传代谢性疾病病例中已确诊遗传代谢性疾病12例。其中疑似有机酸血症28例，确诊3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（MCCD）2例，甲基丙二酸血症（MMA）1例，丙二酸血症（MAD）1例；疑似氨基酸血症19例，确诊苯丙酮尿症（PKU）3例；疑似脂肪酸血症18例，确诊原发肉碱缺乏症（PCD）5例。海南省黎族新生儿多种遗传代谢性疾病发病率为59/10万（12/20 307）。详见表1。

2.2 基因突变分析 在已确诊的12例遗传代谢性疾病患儿中，5例PCD发现了3种基因突变：1例c.760C＞T、2例c.51C＞G和2例c.338G＞A，其中4例男婴、1例女婴。3例PKU中发现了3种基因突变：c.1081A＞T、c.728G＞A和c.764T＞C，其中2例女婴、1例男婴。2例MCCD基因突变位点均为c.1331G＞A，且均为女婴。1例MAD基因突变位点为c.541G＞A，患儿为女婴。1例MMA基因突变位点为c.456delT，患儿为男婴。部分基因测序图详见图1。

3 讨论

遗传代谢性疾病是新生儿疾病筛查的重要内容之一，国内外专家一致认为早期筛查并及时予以有效治疗是确保新生儿健康成长的关键［8-10］。遗传代谢性疾病对新生儿的身体发育、神经发育以及脑功能造成严重影响，是不可逆的损伤，甚至死亡［11-12］，不但给家庭带来巨大经济负担，而且也会影响人口素质。串联质谱技术因能够筛查出有机酸代谢异常、氨基酸代谢异常和脂肪酸代谢异常等疾病，现在已是筛查遗传代谢性疾病的主要手段［13］，在国外已经将其应用在新生儿的遗传代谢性疾病筛查领域中［14］。本研究通过串联质谱技术对海南省20 307例黎族新生儿进行遗传代谢性疾病筛查后，发现黎族新生儿遗传代谢性疾病患病率高达4.14%，这为该地区遗传代谢性疾病的诊治提供了诊断方向。

表1 20 307例黎族新生儿串联质谱筛查情况（例）Table 1 Screening results of 20 307 newborns of Li ethnic group by tandem mass spectrometry

图1 部分确诊遗传代谢性疾病基因测序图Figure 1 The gene sequencing graph of partial confirmed IEM patients

3.1 PCD发病率 据报道在正常人群中PCD的基因携带率很高，为0.5%～1.0%［15］，而本次确诊了5例PCD，1例 c.760C＞T、2例c.51C＞G 和 2例 c.338G＞A，黎族新生儿遗传代谢性疾病以PCD居多。PCD的致病基因为SLC22A5，定位在染色体5q31.1，有10个外显子和9个内含子。从遗传规律来讲，本病应该是男女患病概率相等，有报道女性发病多于男性［16］，是因为妊娠等应激反应刺激所致。但本次确诊黎族新生儿PCD中4例为男婴，1例为女婴，与已见报道相异。海南省地处祖国最南端，气候有别于他地，当地人生活环境和方式是否与PCD高发相关有待深入研究。本病存在地域和种族差异，各地域报道突变位点不同［17］：中国上海的突变位点P.R254X最高，高加索人群常见R282X，意大利人为R169W，东亚人群常见W132X和W283C，而海南省黎族新生儿确诊3种突变位点：c.760C＞T、c.51C＞G 和c.338G＞A，其中 c.760C＞T和 c.51C＞G 是中国人群最常见突变［18］，而c.338G＞A是一种极为罕见的突变，该位点直到2017年［19］才被确认。

海南省黎族绝大部分聚居地属贫困地区，因交通不便、经济落后和民俗等原因，黎族种族血统较为纯粹，近亲婚配发生率高，造就了遗传代谢性疾病PCD发生率增加，本次初步计算出黎族新生儿PCD发病率为1/4 061（5/20 307），与国内上海2.4/10万、浙江3.1/10万［17］相比，均较高。中华人民共和国国家卫生健康委员会（http：//www.nhc.gov.cn/）2009-06-01开始实施的《新生儿疾病筛查管理办法》（原卫生部令第64号）规定新生儿必须进行PKU和先天性甲状腺功能低下症（CH）两个病种的筛查，从海南省2007年开展新生儿筛查以来，笔者曾报道海南省PKU的发病率为1/34 362［20］，CH的发病率为1/3 230［21］，而本次少数民族地区海南省八市县新生儿PCD发病率高于PKU，接近CH，况且PCD又是治疗效果良好的疾病，因此有理由建议在海南省黎族人群开展PCD新生儿筛查。

3.2 PKU发病率 PKU是一种常见的常染色体隐性遗传代谢病。该疾病主要引起智力障碍。《新生儿疾病筛查管理办法》已经规定PKU是新生儿疾病筛查的必筛病种，串联质谱技术既可以检测Phe和Tyr的浓度，又可以结合Phe/Tyr比值进行判断，更有利于PKU的早期发现与诊断。

在本次调查研究中，确诊了3例PKU，并且检 出 了 3种 基 因 突 变：c.1081A＞T、c.728G＞A 和c.764T＞C。c.1081A＞T属 无 义 突 变， 美 国 医 学 遗传学与基因组学会（ACMG）［22］定义为致病突变（PVS+PM2+PM3+PM5+PP4），PVS：该变异为零效变异（无义突变），可能导致基因功能丧失；PM2：在正常人群数据库中的频率为0.000 02，为低频变异；PM3：隐性遗传病；PM5：相同位置的突变在HGMD数据库已有报道但氨基酸变化不同；PP4：患者表型高度特异于单一遗传基础的疾病；目前HGMD数据库未有该位点的相关性报道，经家系验证分析患儿父亲该位点杂合变异，母亲该位点无变异。生物信息学蛋白功能预测软件SIFT、PolyPhen_2、REVEL分别预测为未知、未知、未知。

L255S突变目前在国内报道2例，1例出现在北方，1例出现在河南［23］，海南黎族人群此次检出属第3次，说明L255S属于较少见的突变类型，而且从北方人群到南方人群均存在。另1例p.R243Q位于7号外显子突变，这也是我国北方人群常见突变类型。

3.3 MCCD、MMA和MAD发病率 在20 307例新生儿当中筛查疑似有机酸血症28例，高于疑似氨基酸血症19例和脂肪酸血症18例，有机酸血症患病率高达1/725（28/20 307），说明黎族新生儿有机酸血症患病率高。目前确诊了4例，分别是MCCD 2例、MMA 1例和MAD 1例。MCCD是一种常染色体隐性疾病，目前海南省20 307例黎族新生儿确诊了2例MCCD，因存在着偶然性，需要累积足够大的样本量再计算MCCD的发病率。MMA也是一种常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酸辅酶A变位酶自身缺陷或其辅酶钴胺素（cobalamin，cb1，维生素B12）代谢缺陷，导致甲基丙二酸、3-羟基丙酸及甲基枸橼酸等代谢产物异常蓄积，引起脑、肝、肾、骨髓及心脏等多种脏器损伤，造成认知和行为改变的疾病。基因类型可分为：cb1A、cb1B、cb1C和cb1D，其中cb1C是常见类型，而本次确诊MMA为cb1A型。MAD也称丙二酸尿症，是一种极罕见的有机酸血症，该疾病是常染色体隐性遗传病，全世界目前报道仅为30例［18］，主要造成新生儿生长发育迟缓和精神运动发育障碍。本次确诊1例属海南省的首次报道。

MCCD主要是由于MCCC1和MCCC2基因突变所致，本次确诊2例MCCD均为MCCC1型，定位于3q27.1。c.1331G＞A突变导致氨基酸改变致P.R444H（第4444号由精氨酸变异成组氨酸），属错义突变，该变异不属于多态性位点，在人群中发生率极低，HGMD专业版数据库已报道其与3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症相关，与CARROLL等［24］报道相同。

MMA定位在7号外显子4q31.1-q31.2。c.456delT（缺失）导致氨基酸改变p.G153Vfs*8（移码突变）。该变异在正常人群数据库频率为未知。蛋白功能预测软件SIFT、PolyPhen_2、REVEL的预测结果分别为未知、未知、未知。在HGMD专业版数据库中未见报道。经家系验证分析，受检人之父该位点无变异，受检人之母该位点杂合变异。

MAD致病基因位于16q24的MLYCD基因，本次经基因测序后发现患儿为纯合突变。c.541G＞A（编码区第541号核苷酸由鸟嘌呤变异为腺嘌呤），导致氨基酸改变p.V181M（第181号氨基酸由缬氨酸变异为甲硫氨酸），为错义突变。根据遗传变异分类标准与指南［25］，该变异初步判定为临床意义未明。HGMD数据库未有该位点的相关性报道；经家系验证分析，父亲该位点杂合变异，母亲该位点纯合变异；在正常人群数据库中的频率为0.014 00。

对筛查方案的成本效益评估高度敏感的一个重要因素是疾病的发病率［24］，因为遗传代谢性疾病在不同种族之间存在差异。尽管本次样本量较少，但从本研究结果可以看出从20 307例新生儿中确诊12例遗传代谢性疾病，初步计算出海南省黎族新生儿多种遗传代谢性疾病发病率为59/10万，相比欧洲人群发病率29.51/10万高［26］。据研究遗传代谢性疾病在亚洲人群的发生率为16.08/10万～26.35/10万［27］，海南省黎族人群遗传代谢性疾病发病率属高人群。由此认为在海南省黎族人群中进行遗传代谢性疾病的筛查是有意义的。

作者贡献：赵振东、王洁进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，结果的分析与解释，论文的修订；赵振东进行数据收集及整理，统计学处理，撰写论文；王洁负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。