甲维盐对海洋桡足类火腿伪镖水蚤的急慢性毒性效应

衣晓燕，周 强，吕海金，赵美法，韦如意，刘光兴

（1.青岛职业技术学院生物与化工学院，山东 青岛 266555；2.青岛海洋科技馆，山东 青岛 266003；3.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100； 4.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100）

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（简称甲维盐，Emamectin benzoate，EMB）是一种新型的高效半合成抗生素杀虫剂，既有胃毒作用又兼触杀作用，通过打开肌肉和神经组织的氯离子通道，增加膜对氯离子的通透性起作用，从而抑制神经冲动的传输，导致昆虫瘫痪最终死亡[1-2]。在国内被广泛应用于农业害虫防治[3]，在国外被广泛用于鲑鱼的水产养殖业，以杀灭寄生在鲑鱼体内或体表的寄生性鱼虱Lepeophtheirus salmonis和Caligus rogercresseyi[4]。EMB 会随着地表径流或者直接排入的方式进入海洋生态系统，导致海洋水体污染，对海洋生物造成一定影响，尤其对海洋甲壳类具有较强毒性[5-6]。

海洋桡足类作为能流和物流的重要“桥梁”，在维持海洋生态平衡和稳定中起着重要作用[7-8]。浮游桡足类和寄生性桡足类具有类似的生长发育过程，EMB 可以有效杀灭各阶段的寄生性桡足类鱼虱，也对浮游桡足类产生了一定的毒性效应[5]，而且海洋浮游桡足类对环境变化敏感，是反映海洋生态系统受到影响的一种理想的毒性试验材料[9]。

目前，关于EMB 对浮游动物及海洋生态系统毒性的研究国内鲜见，更多的研究聚焦在EMB 对陆生或淡水水生生物的毒性效应研究上[10-11]。笔者选取我国近海浮游桡足类常见种火腿伪镖水蚤（Pseudodiaptomus poplesia）作为研究对象，通过急慢性毒性试验在个体水平上研究不同浓度EMB 对其呼吸、常见氧化酶活性、生殖、生长发育等的影响，为进一步推测和评估EMB 对海洋浮游桡足类产生的毒性效应和整个海洋生态系统可能产生的危害提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 火腿伪镖水蚤的采集与培养

供试火腿伪镖水蚤用浅水Ⅰ型浮游生物网采自青岛近海，采集后即带回实验室暂养。在体视显微镜（S8APO，LEICA）下挑选健康活泼的成体，在光照培养箱（GXZ-280B-LED，宁波江南仪器厂）内用人工海水进行培养。培养条件为：温度22±1℃，盐度（20±1）‰，光照强度3 000 lx，光暗周期14L ∶10D，饵料单胞藻金藻（IsochrysisgalbanaParke8701）的终浓度在104～105个/mL 范围内。

1.2 EMB 溶液的配制

称 取 纯 度 为99.4% EMB（PESTANAL®Sigma-Aldrich，USA）10 mg，溶于5 mL 二甲基亚砜（DMSO），配制成2 mg/mL 的储备液，4℃避光保存。用0.45 μm灭菌膜过滤盐度为（20±1）‰的人工海水，稀释储备液以配制浓度范围0.02～800 ng/mL 的EMB 溶液（表1）。最高浓度梯度中试剂DMSO 的浓度为400 μL/L。每48 h 更换50%的暴露液。

1.3 急性毒性试验

用一次性巴斯德吸管转移火腿伪镖水蚤成体，暴露在不同浓度EMB 溶液中96 h （表1），以获得96h-LC50。试验在装有80 mL 膜滤海水的100 mL 玻璃烧杯中进行，试验条件同培养条件。每天早上9：00 在解剖镜下观测并记录个体存活情况，直至96 h。解剖针轻触或水流缓慢冲击，无反应者视为死亡。同样，为获得24h-EC50，将成体暴露在不同浓度EMB 溶液中 （表1），24 h 后观测并记录未死亡但活动能力明显减弱（长时间趴在烧杯底部静止不动，解剖针触碰或水流缓慢冲击才有反应）的个体数。

根据24h-EC50设置浓度梯度（表1），将成体暴露在不同浓度EMB 溶液中，24 h 后观测火腿伪镖水蚤的呼吸率以及过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase, GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）、超氧化物歧化酶（superoxide disnmtase, SOD）等生理指标的变化。呼吸率试验在装有200 mL 膜滤海水的200 mL玻璃磨口瓶中避光进行；氧化酶活性试验在装有800 mL 膜滤海水的1 L 玻璃烧杯中进行。

1.4 亚慢性毒性试验

火腿伪镖水蚤N1 期无节幼虫孵出24 h 内，挑选健康活泼的幼体将其分别暴露在不同浓度EMB 溶液中（表1）。试验个体在EMB 中持续暴露30 d，每只个体单独培养在装有7 mL 膜滤海水的10 mL 细胞培养板中，每48 h 更换50%体积的EMB 溶液并投饵，试验条件同急性毒性试验。当雌性个体发育至性成熟时，挑选健康活泼的雄性个体2～3 只，混合培养。每天15: 00 在解剖镜下观察并记录个体的存活、所处发育阶段、抱卵及孵化情况。

表1 火腿伪镖水蚤毒性试验设置

各浓度组90%的无节幼虫发育至桡足幼体（C1）所需的时间即为无节幼虫发育成桡足幼体所需的时间；90%的桡足幼体成功发育至成体（C6）的时间即为桡足幼体发育成成体所需的时间；记录雌性个体首次抱卵的时间，计算孵化率[12]。

1.5 数据分析

利用改良的寇氏法计算求得96 h 的半数致死浓度（96h-LC50）[12]，添加趋势线求得24h-EC50。用溶氧 仪（Yellow Springs Instruments，YSI5000）测得溶解氧含量以计算耗氧率[13]。根据南京建成生物工程研究所（http://www.njjcbio.com/）提供的试剂盒，用紫外可见分光光度计测定CAT、GST、GSH-Px 和SOD 的酶活。

用SPSS 19.0 软件中的One-way ANOVA 进行单因素方差显著性分析，用Origin 8.5 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 EMB 对火腿伪镖水蚤的急性毒性

由表2 可知，不同浓度EMB 溶液暴露下，火腿伪镖水蚤的96h-LC50为22.9 ng/mL（18.9，28.1）。由图1 可知，不同浓度EMB 溶液暴露下，火腿伪镖水蚤的24h-EC50为16.5 ng/mL。

表2 不同浓度EMB 溶液暴露下火腿伪镖水蚤的死亡率 （%）

由图2 可知，随着EMB 浓度的增加，24 h 内火腿伪镖水蚤成体的呼吸率总体呈现先上升后下降的趋势。当EMB 浓度在1.25～2.5 ng/mL 范围内时，随着浓度的增加呼吸率显著升高；当浓度高达20 ng/mL 时，呼吸率显著降低。

从图3 中可以看出，暴露24 h 后，随着EMB 浓度的升高，火腿伪镖水蚤的GPx、CAT 和SOD 的活性均发生显著变化，而GST 的活性变化不明显。其中，GPx 的活性一直处于较高水平；CAT 在较低浓度（2.5 ng/mL）时活性较高，在高浓度（10～20 ng/mL）范围内活性受到显著抑制；SOD 的活性变化趋势与CAT的正好相反，在低浓度（1.25 ng/mL）下活性较低，在高浓度（20 ng/mL）下活性显著升高。

2.2 EMB 对火腿伪镖水蚤的亚慢性毒性

如图4 所示，随着EMB 浓度的升高，火腿伪镖水蚤卵的孵化率呈现先升高后降低的趋势。与对照组相比，在0.02～0.2 ng/mL EMB 浓度下火腿伪镖水蚤卵的孵化率显著提高，孵化率由3.3±0.5 个/d 增加至5±0.5 个/d；浓度继续升高至0.2～1 ng/mL 范围内，孵化率开始下降；当EMB 浓度达到2 ng/mL 时，火腿伪镖水蚤卵不能正常孵化。

从图5A 中可以看出，海水对照和溶剂对照处理下，火腿伪镖水蚤N1 期无节幼虫发育至桡足幼体C1所需的时间为6 d，存活率和发育率均为100%；在0.1 ng/mL EMB 处理下，时间缩短至5 d，存活率降至90%，存活的个体均成功发育为桡足幼体；在高浓度（2 ng/mL）处理下，存活率降至73%，存活个体中仅有85%的个体成功发育为桡足幼体。这表明不同浓度EMB 暴露下，无节幼虫的生长和发育均受到影响，随着EMB 浓度升高，无节幼体存活率和发育率呈明显下降趋势。

从图5B 中可以看出，海水对照和溶剂对照处理下，桡足幼体C1 发育为成体C6 所需的时间为13 d，在 0.02～0.1 ng/mL EMB 处理下，其发育时间缩短至10～ 11 d，在1 ng/mL EMB 处理下，发育时间延长至15 d；当桡足幼体暴露在0.1 ng/mL 及以上浓度下时，随着浓度的增加，其存活率和发育率均呈现下降的趋势，存活率降至30%～50%，存活的个体中发育率降至30%～40%，当浓度高达2 ng/mL 时桡足幼体几乎无法存活。

3 讨 论

国外关于EMB 对海洋生物的毒性研究较为普遍。 EMB 对美洲牡蛎（Crassostreavirginica）的96h-LC50为 670 ng/mL，对杂色鳉鱼（Cyprinodonvariegatus）的96h- LC50为43 000 ng/mL，对太阳鱼（Lepomismacrochirus）的96h-LC50为1 800 ng/mL[14]，对糠虾（Mysidopsisbahia）的96h-LC50为0.043 ng/mL[15]，对桡足类克氏纺锤水蚤（Acartiaclausi）、伪哲水蚤（Pseudocalanuselongatus）、长角真宽水蚤（Temoralongicornis）及拟长腹剑水蚤（Oithonasimilis）的48 h-EC50为0.12～232 ng/mL[5]。该研究中，EMB 对火腿伪镖水蚤的96h-LC50为22.9 ng/mL （18.9，28.1），24h-EC50为16.5 ng/mL。火腿伪镖水蚤属于对EMB 比较敏感的种类，可作为指示生物用于海洋生态环境中EMB 污染物的监测。

持续暴露在物理（温度、盐度）和化学（重金属、烃类、藻毒素等有毒物质）压力下，水生生物体内会产生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），过量的ROS 会攻击蛋白质、膜脂、核酸等组分，进而损伤细胞结构和功能，甚至导致细胞死亡[16-18]。 SOD、CAT、GST 及GPx 是抗氧化防御系统中重要的抗氧化酶，在保护机体免受过量自由基和过氧化物损害等方面发挥着重要作用[17,19]，可作为氧化胁迫的生物标志物[20]。该研究中，不同浓度EMB 暴露下，随着浓度的升高CAT 的活性呈现先升高后降低的趋势，SOD 的活性呈现先降低后升高的趋势。有学者指出，较低浓度污染物暴露下，通过诱导产生SOD 和CAT，可增强机体消除ROS 的能力，使机体免受损害，是生物体的一种自适应反应；当污染物浓度继续升高，超过了机体的适应能力，作为中毒反应的前兆，氧化酶活性就会降低[21-22]。Krishnakumar 等[23]的研究结果却正好相反，唐学玺等[24]学者在研究蒽对黑鲪超氧化物歧化酶活性的影响时得知在低浓度蒽处理下SOD 活性显著降低。GPx 以催化过氧化物为底物，反应过程中需要有还原性谷胱甘肽（GSH）的参与，有研究表明污染物对水生动物体中的GPx 活性存在诱导作用[25]，且低浓度诱导不明显，高浓度诱导作用显著[26]。该研究中，随着EMB 浓度的升高，GPx 的含量一直处于较高水平。GST 作为Ⅱ相代谢解毒酶也具有过氧化酶的特性，对不同的化学污染胁迫反应不同[27-29]。该研究中，随着EMB 浓度的升高，GST 的活性并无显著变化。综上所述，EMB 暴露下火腿伪镖水蚤的抗氧化系统受到了明显的影响。

不同浓度EMB 暴露下，火腿伪镖水蚤的呼吸率受到明显影响，随着浓度的升高，24 h 呼吸率呈现先升高后降低的趋势。有研究表明，在温度20℃、盐度15‰的环境下，火腿伪镖水蚤呼吸率可达到 0.58 μL/(ind·h)[30]。该研究中设定培养环境为温度20℃、盐度20‰，火腿伪镖水蚤的呼吸率达到0.68 μL/(ind·h)。低浓度EMB 刺激下，火腿伪镖水蚤呼吸率可高达0.96 μL/(ind·h)。这应该是其通过提高自身新陈代谢来主动外排体内累积的外源污染物质。这个过程需要增强呼吸作用以提供充分的能量[31-32]。高浓度EMB刺激下，火腿伪镖水蚤的呼吸率低至0.37 μL/(ind·h)，说明其呼吸作用直接受到抑制。

污染物长期暴露下，即使浓度较低，桡足类动物也会出现异常。耗氧量异常可使体内糖类、蛋白质和脂肪含量及电子转移系统活力受到影响，能量收支失去平衡，进而导致行为表现异常、生长发育期异常、生长率和繁殖率的变化[33-35]。该研究结果表明， EMB 对火腿伪镖水蚤具有慢性毒性效应，会影响处于不同生长阶段的火腿伪镖水蚤幼体的生长和发育。随着EMB 浓度升高存活率和发育率呈下降趋势，在0.02～0.1 ng/mL 的低浓度范围内，EMB 会刺激桡足类的发育，发育时间明显缩短，并且孵化速度明显增加； 而当浓度升至1 ng/mL 时，发育时间明显延长。Brown 等[36]在研究杀虫剂林丹（lindane）对桡足类Bryocamp-tuszschokkei产生的毒性效应时发现，在较低浓度的污染物暴露下，幼体的数量有增加的趋势；Andersen 等[37]和徐东晖等[12]学者在研究污染物对Acartiatonsa或P.poplesia产生的毒性效应时，发现低浓度污染物刺激可引起产卵率、孵化速度的增高。这可能是由于低浓度污染物会提高桡足类对不利环境的耐受性，在低浓度污染物的环境中进行长期暴露，桡足类可能会通过调节自我生理活动来适应不利的环境[38-39]。随着污染物浓度的升高，桡足类受到刺激，摄食减少，代谢增加，导致其发育至成体的时间明显延长[36]。随着污染物浓度的继续升高，幼体发育率显著降低，使桡足类的数量明显降低，从而影响该桡足类的种群数量，导致种群的衰退[35,40]，引起浮游动物群落结构的改变，从而对整个生态系统造成不利影响。

EMB 可以被桡足类动物主动摄入，也会被动扩散至生物体内，从而对机体产生不可逆的毒性作用[5]。尽管目前海洋环境中的EMB 浓度并不高，平均浓度约为 8.28×10-6ng/mL[5,41]，未影响到海洋浮游生物群落的丰度、结构和功能[6]，但随着EMB 的大量使用，通过食物网的传递，必然会威胁到整个海洋生态系统乃至人类的健康。因此，对于合理使用EMB 等新型农药以及探讨其对海洋生物产生的毒性效应等研究需要更深入地挖掘。