猪δ冠状病毒基因组学及诊断技术研究进展

张 森，杨 伟，汤德元，曾智勇，黄 涛，王 彬， 石远菊，叶 丽，郭倩妤，廖少山

(贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种能够引起猪严重腹泻、脱水的肠道病毒[1]。PDCoV属于冠状病毒科，δ冠状病毒属的单股正链RNA病毒。PDCoV于2012年在中国香港被首次发现，随后陆续在其他国家被发现，目前，韩国、美国、中国、日本、老挝、加拿大、越南等国已有报道，我国大部分地区均有检出，对我国养猪业造成了严重损失[2-5]。感染PDCoV后发生的主要临床症状与感染猪传染性胃肠炎(TGE)、猪流行性腹泻(PED)、猪轮状病毒病(PoRV)症状相似且临床上难以区别，都能引起腹泻、脱水、呕吐，最终导致死亡[6]。PDCoV一般感染猪消化道，通过粪便排出，偶尔也可以通过呼吸道进行传播。本文主要通过对PDCoV的病原学特征、临床症状、诊断技术研究进展进行综述，旨在为兽医工作者及科研工作者对该病的研究及诊断提供理论参考。

1 病毒基因组结构

PDCoV是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科、δ冠状病毒属，病毒颗粒呈球形或多型性，病毒直径约为100 nm，与其他冠状病毒类似，有囊膜和许多末端凸起的纤突，PDCoV基因组大小为25.4 kb，是目前发现的基因组中最小的冠状病毒成员[7-8]。PDCoV有5′帽子结构/3′poly A尾和8个开放阅读框(ORFs)，病毒基因组依次包括：5′非翻译区(UTR)、开放阅读框1a/1b(ORF1a/1b)、纤突蛋白基因片段(S)、包膜蛋白基因片段(E)、膜蛋白基因片段(M)、非结构蛋白6(NS6)、核衣壳蛋白基因片段(N)、非结构蛋白7(NS7)和3′非翻译区(UTR)[4]。MARTHALER等[9]将美国的几株PDCoV病毒进行基因测序后与中国PDCoV病毒测序进行对比，结果发现，E区片段最保守，相似度为99.6%；S区片段差异性最大，相似度为98.5%～98.8%。目前对冠状病毒的结构和非结构蛋白的一般特征及其在病毒复制中的作用已经明确，但PDCoV的结构和非结构蛋白在感染宿主细胞的详细功能和作用目前还没有完全破解。近期LEE等[10]研究表明PDCoV 的N蛋白参与PDCoV感染的早期阶段通过上调宿主细胞的热休克蛋白70(HSP70)的2个伴侣蛋白GRP78及HSC70来抑制宿主细胞凋亡，且N蛋白可与EF1α相互作用完成病毒在宿主细胞内的复制，这一点与其他冠状病毒入侵宿主细胞的机理相似。

2 临床症状

PDCoV的临床症状为食欲减退、急性水样腹泻、轻度或中度呕吐、脱水、嗜睡等，仔猪偶尔会因为脱水而导致死亡，病死率为30%～40%，成年猪发病后会自行恢复、死亡率低，常呈一过式反应[6]。JUNG等[11]将2株PDCoV(OH-FD22和OH-FD-100)分别感染7只SPF猪，接种后21～120 h，所有猪表现出严重的腹泻、呕吐、十二指肠至结肠肠壁变薄，且肠腔中有大量黄色液体，病理结果显示存在严重的萎缩性肠炎，盲肠和结肠中浅表上皮细胞的轻度空泡化且发生腹泻48 h后即可从粪便中检出病毒。被PDCoV感染后的猪会经常受到TGEV、PEDV、PoRV等病毒的混合感染。MARTHALER等[9]对美国的TGE、PED、PoRV发病猪进行调查，发现患有以上疾病的猪粪便中大多可以检测到PDCoV，表明PDCoV常与其他引起腹泻的病毒混合感染。一旦出现混合感染的情况，死亡率极高，有时可达到80%以上[12]。该病毒同时也会感染鸟类和哺乳动物，JUNG等[13]将PDCoV病毒OH-FD22株以口服的方式感染3～7岁的小牛，接种3 d后从粪便中检查到病毒RNA以及在血液中检测到PDCoV特异性血清IgG抗体，但没有引起腹泻等临床症状。

3 实验室诊断技术研究进展

由于猪δ冠状病毒病的临床症状与TGE、PED、PoRV极为相似，导致通过简单的观察临床症状及病理变化无法得出结论，所以对PDCoV的实验室临床诊断方法的研究就十分重要。目前对PDCoV实验室诊断方法有PDCoV病毒的分离培养、酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR、荧光定量RT-PCR、mRT-PCR、环介导等温扩增(LAMP)等。

3.1 病毒的分离培养PDCoV 病毒的分离培养可以采用猪睾丸细胞系(ST)和猪肾细胞系(LLC-PK)等作为宿主细胞感染。刘宝京等[14]将河北养殖场采集的PDCoV 病毒样品感染ST细胞并观察细胞病变，发现ST细胞在感染后12～24 h出现CPE，且细胞明显变大、变圆，最后脱落，提取该细胞培养物进行RT-PCR检测显示扩增条带与目的条带相符，测序结果与其他PDCoV 毒株相近，说明成功分离出1株PDCoV 病毒。美国HU等[15]将带有PDCoV 病毒的腹泻样品接种于LLC-PK 细胞培养7 d后通过RT-qPCR等方法证明成功分离出PDCoV 病毒，并命名为OH-FD22。

3.2 ELISA酶联免疫吸附试验是根据抗原与抗体结合原理来对PDCoV 进行诊断，该方法特异性强、敏感度高、使用简单方便、结果准确，是目前最常用的检测抗原或抗体的方法之一。ELISA技术是目前用于检测PDCoV发展最快的血清学方法。

THACHIL等[16]开发了基于PDCoV纤突蛋白(S)的S1部分的抗 IgG间接ELISA试剂盒，并将其用于调查美国猪中PDCoV的流行情况，是全世界首个检测PDCoV的ELISA方法。SU等[17]利用组氨酸标记的重组核衣壳(N)蛋白作为抗原来检测针对PDCoV的抗体，建立了间接ELISA方法,灵敏度可达90%以上，且特异性强，其N蛋白基本不与PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PCV-2、PRV和PRRSV发生血清交叉反应。利用该方法对黑龙江省319份血清样品进行检测，调查结果表明，在没有腹泻的猪场中，有3.33%的样本(7/210)PDCoV呈阳性；发生腹泻的农场，有27.52%的样品(30/109)PDCoV呈阳性，说明在黑龙江省由于感染PDCoV而引发腹泻的可能性很高。OKDA等[18]将N蛋白进行重折叠建立了间接ELISA，与未重折叠N蛋白建立的间接ELISA方法相比，特异性更强、灵敏度更高。LUO等[19]开发了一种基于重组膜蛋白(M)的ELISA，该方法和以N蛋白建立的间接ELISA方法相比与PEDV的交叉反应更弱，效果更好。

3.3 RT-PCRRT-PCR方法是目前最常用的分子生物学诊断方法之一,其具有操作简单、反应速度快、价格低廉等优点，目前在大多数实验室已经普遍运用。近年来研究人员建立了多种RT-PCR方法检测PDCoV，WANG等[20]利用HKU15-155 毒株的M 67F基因片段和N 41F基因片段的保守区分别设计了2组RT-PCR引物，建立了诊断美国PDCoV 的一步法RT-PCR 诊断方法。SONG等[21]建立了巢式RT-PCR 诊断方法用于检测31份猪腹泻样品，成功检测出9个显示出预期片段的RT-PCR产物。韦学雷等[22]建立了PDCoV、TGEV和PE-DV多重RT-PCR 检测方法，该方法相对于单一RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、可以同时检测多种病毒，可用于临床仔猪腹泻的快速检测诊断，具有广阔的应用前景。杨艳楠[23]建立了猪4种冠状病毒的多重RT-PCR检测方法，可以同时检测PDCoV、TGEV和PEDV、猪血凝性脑脊髓炎病毒(P-HEV)，丰富了猪冠状病毒诊断方法。

3.4 Real-time RT-PCR目前已经开发出许多用于检测PDCoV 的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法。qPCR与普通PCR相比，不但可以实时监控DNA扩增的量，而且具有更高的灵敏度和特异性。MA等[24]利用PDCoV的N基因保守片段同时构建了普通RT-PCR和以SYBR Green为染料的RT-qPCR，对比结果显示普通RT-PCR与RT-qPCR相比，特异性相似、但灵敏度RT-qPCR更胜一筹。HUANG等[25]建立了基于TaqMan探针的多重实时RT-qPCR，同时检测4种猪肠道冠状病毒，可以同时检测传染性TGEV、PEDV、猪肠道致病阿尔法冠状病毒(PEAV)和PDCoV，且该方法能检测到10～100个拷贝的4种病毒的基因组。MASUDA等[26]建立了可以同时检测PEDV，TGEV、PDCoV和PoRVA的四重RT-qPCR，丰富了该方法对猪腹泻症状检测的诊断，且后3种病毒均达到了10个拷贝的灵敏度。

3.5 环介导的等温扩增(LAMP)LAMP可以在等温条件下以高灵敏度和特异性扩增核酸，这种新型基因检测技术具有较高的成本效益且可以节省时间，为快速准确地鉴定病毒等其他病原体提供了潜在的有效工具。ZHANG等[27]建立了用于视觉检测PDCoV的特异性和灵敏的RT-LAMP测定方法，该方法针对PDCoV N基因的保守编码区设计了1组引物，并优化了反应条件，使灵敏度达到了10个拷贝，比传统的RT-PCR灵敏100倍，核酸扩增时间可以缩短至70 min，该方法可以快速、特异、灵敏的检测PDCoV。

3.6 恒温热隔绝式PCR(iiPCR)iiPCR是一种病毒的快速诊断方法，该方法原理与PCR技术相似，但相比于PCR技术具有使用方便、反应时间快、可现场诊断等特点，目前已经开发出将探针嵌入核酸中或利用染料进行实时监测的方法，不但降低了检测成本，且有快速现场诊断的潜力，具有良好的发展前景[28]。ZHANG等[29]建立了用于诊断PDCoV 的 RT-iiPCR 诊断方法，并与PDCoV RT-qPCR方法进行比较，结果显示，该方法的灵敏度高且特异性和准确度均达到了100%，说明该方法可靠，可用于未来的临床诊断中。

3.7 重组酶聚合酶扩增法(RPA)RPA是一种可以用于病毒检测的等温扩增方法，通常在25～43℃的条件下5～20 min即可观察结果，具有操作简单、成本低廉、诊断迅速等特点，是一种被认为未来可以替代PCR的诊断方法，已广泛用于病毒检测。MA等[30]以PDCoV 的N基因保守区制备PDCoV备体外转录的RNA标准品，成功建立了PDCoV 的RT-RPA诊断方法，该方法与RT-qPCR相比具有以下几个优点：装置便携；运行时间短(仅需要<30 min)；在1个操作管中使用酶，简化了操作程序并减少污染的可能性;未来可用于实验室外的诊断。

4 展望

PDCoV是近年来新发现的一种引起猪肠道症状的病毒，对世界养猪业造成了严重的损失，严重的影响了全国乃至世界的养殖业发展。目前对该病毒的致病机制、诊断方法和疫苗的研究正在不断发展。由于该病毒与猪其他引起肠道症状病毒发病症状相似，在临床上难以辨别，故对本病混合感染诊断方法及即时诊断方法的建立就显得尤为重要。目前，对该病毒还没有开发出相应的疫苗，相信不久的将来，用于该病毒免疫的疫苗会成功研发。