蓝鳃太阳鱼诺卡氏菌的分离鉴定及药敏分析

陈 梅，冯 艺，陈文强，区庆淦，陈建酬

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东佛山 528231)

蓝鳃太阳鱼(Lepomismacrochirus)属鲈形目太阳鱼科，原产于美国，于1987年首次引进我国[1]。其属温水性小体型鱼类，肉质鲜美，口感好，无肌间刺，生长适温范围广(1～38 ℃)，食性杂，适应性强，易于养殖，是一种集食用、游钓、观赏于一体的淡水名贵鱼类[2]，具有较大的市场价值。

诺卡氏菌(Nocardia)是介于细菌与真菌间的革兰氏阳性菌，常将其归类为细菌，属于放线菌门诺卡氏菌科诺卡氏菌属，以腐生为主，是一种人兽共患的慢性传染病，在水产养殖方面危害极大[3]。鱼类诺卡氏菌病的致病菌主要有鰤鱼诺卡氏菌(N.seriolae)[4]、星状诺卡氏菌(N.asteroides)[5]和杀鲑诺卡氏菌(N.salmonicida)[6]。其中，以鰤鱼诺卡氏菌为主[7]。鰤鱼诺卡氏菌是一种条件致病菌，在鱼体免疫力低下时，很容易通过饵料、鳃、伤口感染，主要症状是病鱼真皮下会形成脓疮，有干酪状坏死情况，鳃上有絮状结节，最明显是脾脏和肾脏上有大量肉眼可见的白色结节，肝、心和鳔上也可见结节[8]。在已有的报道中，诺卡氏菌对乌鳢(Ophicephalussargus)[9]、加州鲈(Micropterussalmonides)[10]、招财鱼(Osphronemusgoramy)[11]、大黄鱼[12]等造成了极大的危害，而蓝鳃太阳鱼的诺卡氏菌病在国内鲜见报道。本研究对患病蓝鳃太阳鱼内脏进行了病原菌的分离鉴定，并对其生物学特征及致病性进行了相关的研究，旨在为养殖蓝鳃太阳鱼诺卡氏菌病的防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝鳃太阳鱼病样采自佛山市顺德区某养殖场，体长(15.3±1.1)cm，体质量(80.3±5.5)g。健康蓝鳃太阳鱼(80.1±5.3)g/尾，购自佛山市某水产养殖场。

试验用脑心浸液培养基(BHI)、琼脂粉、细菌微量生化鉴定管均购于广东环凯微生物有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒及PCR所用的试剂购自北京全式金生物技术有限公司。特异性引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。药物敏感纸片购自杭州滨和微生物有限公司。

1.2 病原菌分离纯化

无菌状态下，从患病蓝鳃太阳鱼的肝脏、肾脏和脾脏中挑取黄豆大小的组织块，轻轻涂抹在BHI培养基上，再划线分离菌株，25 ℃ 恒温培养3-7 d。挑取单个优势菌落在BHI平板上划线分离纯化1～2次，获得纯培养物，接种于BHI肉汤培养基，25 ℃培养3 d后，加入30%无菌甘油，置于-80 ℃保存。

1.3 回归感染试验

健康蓝鳃太阳鱼暂养一周，水温控制在25 ℃，连续充气增氧，无异常情况后进行人工感染试验。90尾健康蓝鳃太阳鱼分为两组，每组3个平行，每个平行15尾。将菌株SD1810液体培养3 d，用无菌生理盐水调整菌液浓度为2.8×107CFU/mL，按照0.2 mL/尾的剂量对蓝鳃太阳鱼进行腹腔注射；对照组蓝鳃太阳鱼则按相同的剂量在相同的部位注射无菌生理盐水。连续观察40 d，每天正常喂养、充氧、吸污、换水，同时观察记录发病症状及死亡情况，对患病蓝鳃太阳鱼重新进行病原菌分离鉴定。

1.4 病原菌生理生化特征

在BHI琼脂培养基中将菌株SD1810进行平板划线，25 ℃恒温培养3～5 d，肉眼观察菌落形态、大小、颜色等。同时，按常规方法进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态。将菌株SD1810接种于BHI肉汤中振荡(120 r/min)培养3 d后，根据细菌生化鉴定管的说明书进行操作，检测细菌各项生理生化指标。

1.5 病原菌16S rRNA基因序列测定及系统发育树分析

将菌株SD1810接种于BHI肉汤振荡(120 r/min)培养3 d后，1 000 r/min离心收集菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取该菌的总DNA作为PCR反应的模板。采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′扩增分离菌株SD1810的16 S rRNA基因序列。反应体系为50 μL，包括：mix 25 μL，ddH2O 19 μL，浓度为10 μmol/L的正反向引物各1 μL，菌株总模板DNA 4 μL；反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

将测序得到菌株SD1810的16S rRNA基因序列在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行BLAST比对,利用MEGA7.0软件中的Clustal W模式进行核苷酸序列比对，再用Neighbor-joining法构建分子生物进化树。

1.6 药敏试验

以无菌生理盐水将菌株SD1810的3 d培养物稀释成1.7×108CFU/mL的菌悬液，取100 μL菌悬液涂布于BHI琼脂平板中，采用K-B纸片扩散法，用无菌镊子将抗生素药敏纸片轻轻贴在培养基表面，每平板放置3片，25 ℃培养7 d后测量抑菌圈直径(mm)。

2 结果

2.1 病原菌的形态特征

从脾脏分离获得的优势菌株SD1810为革兰氏阳性分枝杆菌，无运动性。在BHI琼脂培养基上生长3～5 d可见白色沙粒状菌落，其单菌落较小、表面干燥，显微镜下可观察到灰黑色菌落，边缘不整齐(图1)。接种到BHI液体培养基上静置培养3 d后，菌液澄清透明，底部有少量白色菌体沉淀。

图1 菌株SD1810菌落及菌体形态Fig.1 Colony and morphology of strain SD1810a.菌株SD1810菌落形态；b.菌株SD1810显微镜下菌落形态；c.菌株SD1810菌体形态

2.2 回归感染试验结果

经人工感染发病蓝鳃太阳鱼15 d后开始死亡，病死鱼的主要症状与自然发病蓝鳃太阳鱼症状相似，其体表溃烂出血，有脓疮，鳃丝有少量白色结节(图2a)。解剖后，肝脏、脾脏、肾脏均有大量白色结节,如图2 b所示。从死亡蓝鳃太阳鱼的肝脏、肾脏以及脾脏中均可分离到与原致病菌形态相一致的菌株，在生理生化特性方面完全相同。注射无菌生理盐水的对照蓝鳃太阳鱼无死亡现象，外观特征无明显变化，剖检也未发现任何病理变化。人工感染试验结果如表1。

图2 患病太阳鱼临床症状Fig.2 Clinical symptoms of diseased L.macrochirusa.示病鱼体表溃烂；b.示病鱼肝脏有大量白色结节

2.3 病原菌生理生化特征

由表2可知，病原菌SD1810氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性，产生脲酶，还原硝酸盐，水解明胶，不水解淀粉，水解七叶灵，能以柠檬酸盐为唯一碳源生长，不能利用甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇，不具运动性。根据《伯杰细菌鉴定手册》，该分离菌株具备诺卡氏菌属的基本生理生化特征，且与鰤鱼诺卡氏菌大致相同[7]，可初步鉴定为鰤鱼诺卡氏菌。

表1 人工感染试验结果Tab.1 Test results of artificial injection

表2 蓝鳃太阳鱼病原菌及参照菌株的生理生化特性Tab.2 Physiological and biological characteristics of isolate SD1810 from L.macrochirus and reference strains of Nocardia

注：“+”阳性；“-”阴性

2.4 16S rRNA基因序列分析

采用细菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R扩增得到1 500 bp左右的基因片段，PCR产物凝胶电泳图谱见图3。PCR产物测序结果见表3。同源性检索结果表明，菌株SD1810与诺卡氏菌属的鰤鱼诺卡氏菌核苷酸同源性高达100%。选取17株相关性较高的细菌16S rRNA基因序列进行系统发育分析并构建进化树(见图4)。菌株SD1810与鰤鱼诺卡氏菌MS00018聚为一支，而与其他N.takedensis，N.crassostreae，N.pseudobrasiliensis，N.uniformis等菌株距离较远。结合菌株的形态及生理生化特性，鉴定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌。

图3 16S rRNA PCR结果Fig.3 Results of 16S rRNA amplification

2.5 药物敏感试验

药敏试验结果表明所分离的菌株SD1810对红霉素、庆大霉素、氯霉素、阿米卡星、环丙沙星、复方新诺明、多西环素、氟苯尼考、硫酸新霉素、利福平高度敏感；对呋喃唑酮中度敏感；但对头孢唑啉、诺氟沙星、青霉素、恩诺沙星、阿莫西林和氨苄青霉素有耐药性，结果如表4。

表3 SD1810菌株的16S rRNA基因片段序列Tab.3 16S rRNA gene segment sequence of strain SD1810

续表3

图4 基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of Citrobacter species and other bacterium based on 16S rRNA sequences

3 讨论

在自然界中，诺卡氏菌分布广泛，土壤、活性污泥、水体中均有发现[13]，诺卡氏菌由于其潜伏期长，传染性强，在低温季节容易爆发，目前尚无有效的治疗方法，对水产养殖业的危害极大。鰤鱼诺卡氏菌引发的诺卡氏菌病在中国地区水产养殖中的发病率呈上升趋势[14]，在鱼体免疫力低下或体表有伤口时特别容易感染。鱼体感染诺卡氏菌后典型的症状是肾脏、肝脏、脾脏、鳃等器官出现慢性肉芽肿[15]。有学者认为，诺卡氏菌生长繁殖缓慢，延长病程，致使细菌与坏死组织周围逐渐形成结缔组织包膜，防止细菌扩散，作为机体的保护，从而形成结节；此外，细胞介导免疫反应使巨噬细胞和炎性细胞的增多导致慢性结节中心坏死[16]。鱼类结节致病菌除了诺卡氏菌外还有舒伯特气单胞菌[17]，但两者所形成的结节不一样，诺卡氏菌形成的结节界限明显，有突起感，能导致组织硬化；而舒伯特气单胞菌所形成的结节界限不明显，不引起组织硬化。蓝鳃太阳鱼的诺卡氏菌病在每年的春季和秋季均可爆发，水温在25～28 °C时尤为严重。患病蓝鳃太阳鱼体表有溃烂出血，严重者鳞片脱落，形成较大的脓疮，鳃、内脏组织和器官有大量白色结节，与已报道的乌鳢[9]、加州鲈[10]等诺卡氏菌病的症状相一致。在本次病例中，发病蓝鳃太阳鱼食欲下降，游动缓慢，鱼体发黑，体表溃烂有脓疮，白色结节主要集中在肾脏、肝脏以及脾脏，病灶处组织较硬，其发病适温约25 ℃，发病时间长。对分离的致病菌进行形态观察、生理生化鉴定，结果均符合鰤鱼诺卡氏菌的特征。通过16S rRNA基因序列分析以及系统发育树的构建，SD1810与鰤鱼诺卡氏菌核苷酸的同源性高达100%，与菌株MS00018亲缘关系最近，确定该菌为鰤鱼诺卡氏菌。

表4 鰤鱼诺卡氏菌SD1810的药物敏感性Tab.4 Sensitivity of SD1810 strain to 11 kinds of antibiotics

注：S表示高度敏感；M表示中度敏感；R表示不敏感

鰤鱼诺卡氏菌有两种类型，一种对红霉素敏感，为α葡萄糖苷酶阳性菌；另一种对土霉素敏感，为α葡萄糖苷酶阴性菌[18]。本试验分离的鰤鱼诺卡氏菌株对红霉素敏感，可归类为α葡萄糖苷酶阳性菌。另外，SD1810也对庆大霉素、利福平、氯霉素、阿米卡星、氟苯尼考等10种抗生素敏感，但对头孢唑啉、诺氟沙星、青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素等6种抗生素具有耐药性，与林伟[11]蒋依依[10]徐晓丽[19]等的研究结果不尽相同，这可能与不同地区、不同鱼源的诺卡氏菌病的用药情况有所不同所致，且细菌具有捕获并整合其他菌源的耐药基因的能力[20]，这就使得不同地区的致病菌耐药性不一样。在水产领域中，对鰤鱼诺卡氏菌病的控制仍处于探索阶段。对于α葡萄糖苷酶阴性菌感染的鱼，可在饲料中添加乙酰-D-氨基葡萄糖或柠檬酸，增强病鱼对土霉素的吸收，从而提高疗效[21，22]。抗生素过多的使用容易导致细菌耐药性的产生，而且大多数抗生素属于水产禁用药[23]。由此，当前对诺卡氏菌药物治疗方面的研究多集中在疫苗的研发领域，以降低水产行业对药物的依赖。有研究发现，诺卡氏菌活疫苗、灭活疫苗以及重组γ干扰素均能有效地诱发鱼体保护性免疫[24]，卡介苗对日本牙鲆诺卡氏菌病也有免疫作用[25]。Ho等[26]对诺卡氏菌基因疫苗的研究发现，NGL3388基因编码的蛋白能显著提高鱼体内诺卡氏菌病的抗体滴度，但时效较短，只有2周时间。虽然学术界对诺卡氏疫苗的研究已取得一定的成果，但所得疫苗具有免疫时间短、毒性强、抗原量大，成本高等缺点，未能实现商品化，还需要进一步研发安全性高，经济效益大的核酸疫苗、亚单位疫苗与多肽疫苗等。