四季蜜龙眼FLOWERING LOCUS T(FT)同源基因克隆及其表达分析

邱宏业，朱建华，丁 峰，潘介春，秦献泉，徐 宁，李鸿莉，3，李冬波，彭宏祥，侯延杰，张树伟

(1.广西农业科学院园艺研究所，广西 南宁 530007；2.广西作物遗传改良重点开放实验室，广西 南宁 530007；3.农业部南宁南亚热带果树科学观测实验站，广西 南宁 530007；4.广西大学，广西 南宁 530004)

【研究意义】四季蜜龙眼(Longancv. Sijimi)是广西农业科学院园艺研究所等单位引种选育、于2008年通过广西农作物品种审定委员会审定的热带生态型龙眼新品种[1]。该品种不需要低温诱导即能完成成花转变，且一年可多次开花结果。已有研究对四季蜜龙眼幼叶和芽的SAM、LLFY、SVP、TFL和FLC基因进行克隆及以四季蜜龙眼嫩梢为材料进行转录组测序[2-5]，但均未检测到叶片开花基因FLOWERINGLOCUST(FT)。本研究基于生长调节剂调控四季蜜龙眼夏季成花、秋冬季收果技术，对其成熟叶片中FT基因进行克隆和生物信息学分析，利用荧光定量PCR检测其成花过程不同时期的表达情况，对进一步探讨生长调节剂调控四季蜜龙眼夏季成花的机理具有重要意义。【前人研究进展】成花过程是开花植物生命周期中的一个关键时期，主要由经典的光周期途径、年龄途径、赤霉素途径、春化途径、自主途径和新研究发现的相关途径构成复杂成花诱导网络，如多个成花调控途径通过一些关键整合因子[SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)、FT、和LEAFY(LFY)]形成一个复杂的基因调控网络对植物开花时间进行精密调控[6-11 ]。FT基因处在光周期途径、春化途径、常温途径、年龄途径和赤霉素途径等多条调控途径的交叉点上，受到许多具有染色质重组功能基因和转录因子如CONSTANS(CO)[12-13]、APETALA2(AP2)[14-15]、SCHLAFMUTZE(SME)[16]、FLOWERINGLOCUSC(FLC)[17]、TEMPRANILLO1(TEM1)和TEMPRANILLO2(TEM2)[18]的调控，其表达最终导致植物从营养生长向生殖生长转变，使植物成花。植物FT同源基因的超表达可抑制植物营养生长、促进营养芽进入花芽分化，进而使植物提早开花，如将杨树的开花基因PtFT1和PtFT2分别转入杨树自身，以野生型植株作为对照，发现对照植株开花一般需5～10年，而转基因植株在几个月内即可开花[19]；将柑橘的CiFT基因导入欧洲梨，转基因欧洲梨开花时间显著提早[20]；将苹果2个FT同源基因MdFT1和MdFT2分别转入模式植物拟南芥，转基因拟南芥均提早开花[21]。综上所述，FT同源基因在植物成花调控过程中发挥了至关重要的作用。【本研究切入点】目前，关于以多效唑(PP333)和乙烯利处理四季蜜龙眼不同成熟时期叶片开花基因FLOWERINGLOCUST(FT)表达的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】基于生长调节剂调控四季蜜龙眼夏季成花的技术，对其成熟叶片中FT基因进行克隆和生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR检测其成花过程不同时期的表达情况，探究生长调节剂调控四季蜜龙眼夏季成花过程中成花基因FT的动态变化，为探讨生长调节剂调控四季蜜龙眼夏季成花机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试四季蜜龙眼2010年3月种植于广西农业科学院里建科研基地，采集样品时间为2014年5-6月。主要试剂：核酸染料SYBR®Premix E×TaqTM、TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒、TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Stand DNA Synthesis Kit试剂盒、PremieSTAR Max Premix酶、DL2000 DNA Marker、RNase Inhibitor、Recombinant DNaseI、RNase Free dH2O及克隆载体pMD18-T剂购自TaKaRa公司；Tris-NaAc-EDTA Buffer(TAE)、Tris-HCl-EDTA buffer(TE)、Diethyl Pyrocarbonate(DEPC)和氨苄青霉素(Amp)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；超快新型植物RNA提取试剂盒(Quick RNA Isolation Kit)购自北京华越洋生物科技有限公司；DH5α大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验设计

按照四季蜜龙眼夏季成花技术要求，在四季蜜龙眼二次梢老熟、顶芽未萌动时叶面喷施500.0 mg/L PP333和126.9 mg/L乙烯利混合液1次，7 d后再叶面喷施250.0 mg/L PP333和126.9 mg/L乙烯利混合液1次。单株重复5次。

叶片采集：于第1次喷施PP333和乙烯利混合液前(5月28日)采样1次(0 d)，处理后1、3、5、8、12、16、20和25 d各采样1次，共采样9次。约在上午10：00选取供试植株无病虫梢，采集从顶部往下数第2～3张复叶的第2和3张小叶。每条无病虫梢采集1～2张小叶，每株每次约采集15张叶片。所采集叶片用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 四季蜜龙眼FT同源基因克隆

1.3.1 总RNA提取及DNA消化 采用改良的RNA提取试剂盒Quick RNA Isolation Kit提取四季蜜龙眼叶片总RNA，用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA完整性，用超微量紫外分光光度计检测所提取RNA 的OD260/OD280纯度值和浓度。采用TakaRa公司的DNA酶DNase I处理所提取总RNA样品中残留的DNA。

(1)将室温12 000 r/min、离心10 min改为室温12 700 r/min、离心10 min。

(2)收集RNA时将洗脱液的体积改为70 μl；将12 000 r/min、离心1 min改为12 700 r/min、离心2 min。

1.3.2 cDNA第一条链合成 经检测合格的RNA样品参照反转录试剂盒TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Stand DNA Synthesis Kit(用于基因克隆)和TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser(用于荧光定量PCR)说明反转录合成cDNA，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.3FT同源基因克隆 根据NCBI数据库已公布的其他龙眼品种FT同源基因序列，通过Primer 5.0设计包含完整开放阅读框(ORF)的特异引物，序列如下。FT1-F：5′-CAACCAACAATATTTCACCTGAA-3′,FT1-R：5′-TGGTGTGGGAAACATAGAGA AG-3′,FT2-F：5′-CTTGAATATTTTTGTTTAACACTAC-3′,FT2-R：5′-TTATACGGATTTTGCTAGATAGTTA-3′。

以cDNA为模板，以特异引物FT1-F/FT1-R和FT2-F/FT2-R进行PCR扩增，反应体系25.0 μl：2.5 μl E×TaqBuffer，1.0 μl cDNA，0.5 μl dNTP，引物各1.0 μl，0.16 μl E×TaqDNA酶，18.84 μl RNase free dH2O。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 40 s，55.5 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃停止反应。PCR扩增产物分别进行回收纯化连接pMD18-T后，转至DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定，将阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对测序结果进行比对分析。采用同源克隆的方法，利用特异引物对混合cDNA模板进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳、胶回收、片段连接、转化大肠杆菌、菌液PCR验证及阳性克隆去公司测序等步骤，成功获得2个四季蜜龙眼FT同源基因cDNA全长序列，命名为DlFT1和DlFT2。

1.3.4 生物信息学分析 通过NCBI检索获得四季蜜龙眼FT同源基因DlFT1和DlFT2的同源性；利用BioXM 2.6预测基因编码蛋白；利用ExPaSy提供的在线Protparam软件(http://web.expasy.org/protparamy)对蛋白一级结构的理化特性进行分析；利用ExPaSy提供的在线SOPMA程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/NPSA/npsa_server.html)进行蛋白二级结构预测分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白三级结构；利用MEGA 4.1构建多物种FT同源基因系统进化树。

1.3.5 实时荧光定量PCR 荧光定量PCR所用仪器为LightCycler®480实时荧光定量PCR仪，核酸染料为SYBR®Premix E×TaqTM，2次生物学重复，3次技术重复。根据克隆测序获得的四季蜜龙眼FT同源基因cDNA序列，采用Primer 5.0设计定量特异引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以在各组织及条件下稳定表达的龙眼EF1α基因为内参基因[22]。荧光定量PCR引物为：DlFT1-F：5′-AGTGACCCAACCCTGAGAGA-3′;DlFT1-R：5′-ACTGTCTGCCTGCCTTGTT-3′;DlFT2-F：5′-GCTACACTTTGGTTA TGGTGGA-3′;DlFT2-R：5′-ATAGTCTGCCTGCTCGGTTG-3′;DlEFla-F：5′-GATGATTCCCACCAAGCCCAT-3′;DlEFla-R：5′-GGGTCCTTCTTCTCAACACTCT-3′。

2 结果与分析

2.1 序列分析

从图1～2可看出，四季蜜龙眼FT同源基因DlFT1和DlFT2cDNA的全长序列分别为893和753 bp，对二者的氨基酸序列与基因序列进行分析比对，结果表明，DlFT1和DlFT2基因的ORF均为525 bp，各编码174个氨基酸，DlFT1基因与DlFT2基因的核苷酸同源性为90.00 %，二者所编码蛋白存在24个氨基酸残基差异。

从图3可看出，利用DNAMAN 软件将从NCBI中检索获得的6个其他物种FT同源基因序列与四季蜜龙眼的2个FT基因序列进行序列比对，结果发现8个序列的同源性为46.69 %；而涂黑区域的同源性为100.00 %。四季蜜龙眼2个FT基因序列的ORF长度与其他FT基因序列的ORF长度均相似，约525 bp，均编码约174个氨基酸。

图1 四季蜜龙眼DlFT1和DlFT2基因的氨基酸残基序列比对

图2 四季蜜龙眼DlFT1和DlFT2基因核苷酸序列比对分析

2.2 生物信息学分析

对四季蜜龙眼DlFT1合DlFT2蛋白的理化性质(氨基酸数目、分子量、理论等电点、脂肪族氨基酸指数和蛋白质疏水性等)进行预测分析，结果如表1所示。2个蛋白序列的蛋白质疏水性(GRAVY)均为负值，说明四季蜜龙眼的DlFT1和DlFT2蛋白均为亲水蛋白。

通过ExPaSy提供的在线SOPMA程序对四季蜜龙眼FT同源基因编码蛋白进行二级结构分析，得知其蛋白的二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、转角、延伸链和无规则卷曲组成。2个FT蛋白二级结构主要以丰富的β-折叠(DlFT1，28.16 %；DlFT2，27.59 %)和无规则卷曲(DlFT1，39.66 %；DlFT2，47.13 %)2种形式存在，其次是α-螺旋(DlFT1，19.54 %；DlFT2，14.37 %)。

a：桃(EU939302)；b：苹果(AB161112)；c：向日葵(GU985573)；d：水稻(AB052944)；e：拟南芥(AB465586)；f：荔枝(JN214350)；g：龙眼(DlFT1)；h：龙眼(DlFT2)a：Prunus persica(EU939302)；b：Malus x domestica(AB161112)；c：Helianthus annuus(GU985573)；d：Oryza sativa(AB052944)；e：Arabidopsis halleri(AB465586)；f：Litchi chinensis(JN214350)；g：Dimocarpus longan(DlFT1)；h：Dimocarpus longan(DlFT2)

表1 四季蜜龙眼DlFT1和DlFT2蛋白的理化性质分析

利用SMART 网站http://smart.embl-heidelberg.de/预测的蛋白三级结构如图4～5所示。DlFT1和DlFT2蛋白含有PEBP-euk特殊结构域，每个蛋白均含有7个结构域，但位置略有差异，属于PEBP基因家族的FT-Like蛋白亚家族。

2.3 FT同源基因的系统发育分析

利用MEGA 4.1构建多种植物FT同源基因编码蛋白的系统发育进化树，结果如图6所示。四季蜜龙眼的FT同源基因首先与无患子科的荔枝(JN214350和JN214351)和龙眼(KF881012.1、KF881011.1和KF881010.1)聚在一类，亲缘关系最近；DlFT1基因所编码的氨基酸序列与龙眼(KF881010.1)所编码的氨基酸序列完全一致；DlFT2基因所编码的氨基酸序列与龙眼(KF881012.1)所编码的氨基酸序列完全一致；DlFT1基因所编码的氨基酸序列与荔枝(JN214350和JN214351)所编码的氨基酸序列分别相差24和21个；DlFT2基因所编码的氨基酸序列与荔枝(JN214350和JN214351)所编码的氨基酸序列分别相差15和6个；DlFT1和DlFT2与拟南芥(双子叶植物)亲缘关系较近，与水稻(单子叶植物)的亲缘关系较远。综上所述，FT基因在双子叶植物和单子叶植物间、不同科属植物间及同种物种中存在分化，说明重要的开花基因FT在植物进化过程中有所保守，但也在不断进化。

2.4 实时荧光定量PCR分析结果

采用实时荧光定量PCR分析生长调节剂处理四季蜜龙眼后不同时期成熟叶片的DlFT1和DlFT2基因表达情况，结果如图7所示。田间观察四季蜜龙眼成花调控处理后的成花过程：①顶芽萌动时期(3～7 d)，此时期顶芽由未萌动的叶芽状态逐渐伸长，由僵硬变软，丝状小叶伸展；②花序原基出现期(8～12 d)，丝状小叶腋间出现花序原基(又称红点)，逐渐生长为混合花芽；③花穗生长期(12～24 d)，混合花芽继续生长，丝状小叶逐渐脱落，花穗主、侧轴生长，花蕾形成；④花期(25 d后)，花穗中的小花陆续开放。综合田间观察和实时荧光定量PCR分析结果，在生长调节剂处理的0～8 d，即四季蜜龙眼花芽分化的关键期，DlFT1基因在成熟叶片中表达量呈波动性变化，总体上呈上升变化趋势(但在处理12 d时有明显下降现象)，在处理12 d后，即花器官发育和开花期，DlFT1基因在成熟叶片中的表达量明显升高(图7-A)，而DlFT2基因的表达量随着生长调节剂处理时间的延长(除在处理12 d时有明显下降现象外)总体上呈上升变化趋势(图7-B)。

图4 DlFT1蛋白保守结构域预测分析

图5 DlFT2蛋白保守结构域预测分析

图6 基于植物FT同源基因编码蛋白氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树

3 讨 论

因四季蜜龙眼属于多酚多糖植物，提取其高质量的RNA较困难。本研究对四季蜜龙眼叶片RNA提取方法进行适当的优化改进，提取获得的RNA纯度高、条带清晰、完整性好，OD260/OD280值在1.90左右，OD260/OD230值在2.10左右，且稳定性较好，可满足后续分子生物学研究的要求。

A：DlFT1基因的表达情况；B：DlFT2基因的表达情况A：Relative expression levels of DlFT1 gene assayed with RT-qPCR；B：Relative expression levels of DlFT2 gene assayed with RT-qPCR

由于FT同源基因在植物成花调控中具有整合因子的作用，即多个成花调控途径均汇聚于此，使得FT基因的分离克隆及功能研究得到迅速发展，且近年来对FT基因的研究更深入，相继成功克隆获得葡萄(Carmonaet al.，2007)[23]、大豆(胡瑞波，2009)[24]、蔷薇科植物(左阳，2010)[25]、荔枝(Ding et al.，2015)[26]等物种的FT基因，但有关龙眼FT基因的研究仅见Heller等[22]克隆出龙眼的3个FT基因。

本研究克隆四季蜜龙眼DlFT1和DlFT2基因的cDNA编码区与GenBank数据库中的龙眼FT基因KF881010.1和KF881012.1具有99.00 %的同源性。其中，DlFT1和DlFT2基因的ORF均为525 bp，各编码174个氨基酸，DlFT1与DlFT2基因的核苷酸高度同源，同源性达90.00 %，二者的氨基酸序列存在24个氨基酸残基差异，但其编码蛋白的二级和三级结构相似。由此推测编码DlFT1和DlFT2基因在功能上有所保守的同时，也在向不同的方向进化。Banfieid等[27]研究认为，FT基因不同物种间位于第70和74位的D-P-D-X-P基序、第86位的组氨酸残基、第115和118位的G-X-H-R基序具有显著的序列同源性区域。本研究获得FT基因编码的蛋白含有上述高度保守区域结构，推测四季蜜龙眼FT同源基因和其他物种的FT同源基因高度保守，且在蛋白空间结构及结构域上高度相似，即不同物种的FT同源基因功能具有相似性。

本研究还发现，在植物生长调节剂处理四季蜜龙眼叶片的0～8 d，其DlFT1基因的表达量总体上呈波动性上升变化趋势，而DlFT2基因的表达量随着处理时间的延长呈总体上呈上升变化趋势，在处理8 d时四季蜜龙眼已出现花序原基；在植物生长调节剂处理12 d时二者的表达量明显下降，可能与喷施第2次PP333和乙烯利混合液有关；DlFT1和DlFT2基因的相对表达量在植物生长调节剂处理后3～8 d(顶芽萌动期和花序原基出现期)较处理后8～25 d(花器官发育及开花阶段)有明显上升趋势，分别在处理的20和25 d(初花期)达最大值，推测DlFT1和DlFT2基因在PP333和乙烯利诱导四季蜜龙眼成花转变过程中发挥了关键作用，且DlFT2基因起主导作用，但2个基因的功能也可能有所不同。为进一步探索DlFT1和DlFT2基因在PP333和乙烯利诱导四季蜜龙眼成花转变过程中的作用，还需构建DlFT1和DlFT2基因的超表达载体，并转入拟南芥中进行功能验证。

四季蜜龙眼成花调控除与其生长特性有关外，还受营养物质、光照、水分及温度等外界环境的影响，但这些影响与重要开花基因间的关联尚待进一步探究。

4 结 论

四季蜜龙眼FT同源基因DlFT1和DlFT2均属于PEBP基因家族的FT-Like蛋白亚家族，在PP333和乙烯利诱导四季蜜龙眼成花转变过程中发挥关键作用，且DlFT2起主导作用。