流式细胞仪检测微细胶黏物中尼罗红染料选择性吸附的研究

张新莉 杨晓莉 潘玙璠 卞能源 卜 鑫侯庆喜 裴继诚，* 张方东，*

（1.天津科技大学天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457；2.新疆哈密市环境保护监测站，新疆哈密，839000）

胶黏物给废纸回用带来很大危害，因此废纸浆中胶黏物的去除已成为研究重点。不同手段有不同的去除效果，关键是寻找一种快捷而高效的检测方法。但由于胶黏物来源广泛，成分复杂，其分类不同，检测方法也不同。按照胶黏物的粒子尺寸大小，一般可将其分为大胶黏物、微细胶黏物、溶解和胶体类物质[1]，如表1 所示。其中大胶黏物的分析检测普遍使用TAPPI T 277 标准[2]和INGEDE 法[3]，这些方法是通过筛选操作结合图像分析来对大胶黏物进行分析检测，能够通过筛板筛选的是微细胶黏物。目前采用的分析检测手段多种多样，如浊度法[4]、有机溶剂抽提法[5]、冷藏过滤法[6]等。但由于这些检测方法普遍耗时较长、操作量大，容易产生检测误差，不适于实际生产使用，因此具有一定的局限性和不准确性。

表1 胶黏物分类

2002 年，BASF 公司提出荧光计数法，结合流式细胞仪对微细胶黏物进行分析检测[7]。相比于传统的检测方法，流式细胞仪具有快速、直观和操作简便等优势，能够更加直接地观察到浆料中微细胶黏物的数量、颗粒大小变化及胶黏物控制效果[8-10]。流式细胞仪以激光为光源照射样品流，使荧光染色的颗粒激发荧光并产生标记和计数，检测中荧光探针的使用直接关系到检测结果的准确性。检测微细胶黏物常用尼罗红（Nile Red）作为荧光探针，尼罗红（9-（二乙胺基）-5-氢-苯并[a]吩恶嗪-5-酮）是一种独特的中性疏水探针，在疏水环境中可以发出强荧光[11-12]，其激发波长为488 nm，发射波长为570 nm[13]，常作为荧光染料用于脂类和蛋白质等的染色。胶黏物由于含有脂类物质如甘油三酸酯（TG）、聚丙烯酸酯（PA）等，可被Nile Red 吸附，但白水中除了微细胶黏物还存在细小纤维和无机填料等物质，因此Nile Red 对微细胶黏物的选择性吸附对于流式细胞仪检测微细胶黏物尤为重要。本研究着重探究Nile Red 染料对白水中微细胶黏物及其他细小组分的吸附情况，验证流式细胞仪检测结果的准确性，从而为流式细胞仪更快速、便捷的应用于造纸领域提供借鉴。

1 实 验

1.1 材料及试剂

漂白硫酸盐针叶木浆（NBKP）浆板为智利银星牌商品浆；国产旧瓦楞箱纸板（OCC）和旧报纸（ONP）；Nile Red染料，德国Sysmex Partec Gmbh；纤维素酶，酶活700 EGU/g，诺维信公司（Novozymes A/S）；冰醋酸，天津市永大化学试剂开发中心；三水合乙酸钠，天津市北方天医化学试剂厂。

1.2 实验仪器与设备

流式细胞仪：CyFlow®Cube 6，德国Sysmex Partec Gmbh；DDJ 动态滤水仪：MT2110-086CF，美国；快速水分测定仪：HB43-S，瑞士METTLER TOLEDO；标准疏解机：970154，瑞典L&W公司。

1.3 实验方法

1.3.1 白水样品的制备

将漂白硫酸盐针叶木浆板撕成小块，浸泡后用Valley 打浆机疏解20 min，调节浆浓至1%，充分打散后再经动态滤水仪过滤（100 目滤网），滤液为含有细小纤维和少量残余抽出物的白水。将废纸浆（ONP 浆和OCC 浆）浸泡过夜后用疏解机疏解10 min，调节浆浓为1%，再经动态滤水仪过滤（100目），滤液即为含有细小纤维、少量残余抽出物及其他人工合成类胶黏物的白水样品。

1.3.2 白水样品的染色

取100 μL 白水，滴加Nile Red 染料10 μL，充分混合后置于常温暗处静置5 min染色。

1.3.3 苯-醇抽提处理

准确称取2 g 漂白硫酸盐针叶木浆板，用预先通过苯-醇混合液抽提过的滤纸和棉线包扎好，置于索氏抽提器中，加入约150 mL 的苯-醇混合液（超过抽提器的溢流水平），装上冷凝器后置于水浴锅中，从第1滴混合液滴下时开始计时，抽提时间为6 h。

1.3.4 白水中细小纤维的降解

取100 mL白水，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液将样品pH值调节为4.8，然后添加纤维素酶，纤维素酶的最佳用量为15 EGU/100 mL白水。将加入纤维素酶的白水样品置于温度为50℃的恒温摇床中，在转速150 r/min条件下处理24 h[14]。

1.3.5 胶黏物检测标准门的划分

胶黏物检测标准门的划分用来区分Nile Red 染料吸附的颗粒和Nile Red 染料未吸附的颗粒。通过对比OCC、ONP 两种常见废纸浆在Nile Red 染料染色前后的检测结果，圈划出胶黏物区域，排除系统误差及背景的影响，将其叠加后得到如图1所示的标准门。该标准门在图1 中各个点的坐标分别为（111，330）（4295， 261）（17791， 743）（12415， 14996）（5330，26192）（828，18777）（200，13706）（93，7237）（69，2944）（82，500）。

图1 胶黏物检测标准门

图2 FSC光强-粒径标准曲线

1.3.6 颗粒粒径标准曲线建立

流式细胞仪中前向角散射（FSC）的光强与颗粒尺寸正相关，取已知粒径2.0、5.11、7.61、10.1、16.2 μm 标准微球，通过流式细胞仪检测，得到不同粒径微球对应的FSC 光强，绘制如图2 所示的FSC 光强与粒径的标准曲线[15]。由图2 可以看出，FSC 光强与颗粒粒径呈线性相关，两者的线性相关系数（R2）为0.9922，拟合度较好。

2 结果与讨论

2.1 Nile Red染料对废纸浆的染色效果

为了验证Nile Red染料对废纸浆白水中疏水性物质的吸附情况，用Nile Red染料对ONP、OCC废纸浆白水染色，通过流式细胞仪检测得到其颗粒浓度和FSC光强，并计算颗粒的平均粒径，结果如表2所示。两种废纸浆染色前后FSC-FL3图分别如图3和4所示，其中FSC为前向角散射，FL3为第三荧光通道。由表2可知，两种废纸浆白水中颗粒浓度分别为1487个/μL和1838个/μL，FSC光强分别为760和819，白水中颗粒平均粒径分别为3.20 μm和3.28 μm。从图3和图4可以看出，在加入Nile Red染料染色后，大部分疏水性颗粒具有了荧光性，出现在划定的胶黏物门中，说明Nile Red染料可对ONP和OCC两种废纸浆中疏水性颗粒选择性吸附。

2.2 浆料用水对Nile Red染料染色的影响

由于白水中成分复杂，胶黏物标准门中检测到的颗粒无法确定全部为微细胶黏物颗粒。为了进一步分析废纸浆中所检测到的颗粒是否全部为微细胶黏物的颗粒，首先通过Nile Red 染料对实验过程中用到的自来水（模拟造纸用水）和超纯水进行染色，检测结果见表3。由表3 可知，自来水可能由于管道运输等原因，其中存在一些疏水性颗粒可被Nile Red 染料吸附并被流式细胞仪检测到，其颗粒浓度达到62 个/μL，平均粒径为3.15 μm，对实验结果有一定影响。超纯水中几乎不含有能被Nile Red 染料吸附的颗粒物质，其颗粒浓度几乎为0。因此可以排除检测过程中超纯水对实验结果的影响。在接下来对漂白硫酸盐针叶木浆白水染色的实验中所有用水均使用超纯水，排除自来水对结果的影响。而在实际应用时可提前对工厂实际用水进行检测排除，减少流式细胞仪检测误差。

表2 ONP白水和OCC白水中颗粒浓度、FSC光强和平均粒径

图3 Nile Red染料染色前后ONP浆白水FSC-FL3图

图4 Nile Red染色前后OCC浆白水FSC-FL3图

表3 自来水和超纯水中颗粒浓度、FSC光强和平均粒径

2.3 白水中其他细小组分对Nile Red染料染色的影响

2.3.1 抽出物对Nile Red染色的影响

使用超纯水排除了浆料用水对Nile Red染料的影响后，再对白水中其他组分进行检测。胶黏物一般分为天然树脂和人工合成物两大类。天然树脂一般指木材抽出物，主要来源自原生纤维，主要包括树脂酸、脂肪酸、甘油三酸酯、树脂、蜡、脂肪、甾醇酯等物质。利用苯-醇抽提排除漂白浆中的抽出物，再经Nile Red染料对苯-醇抽提前后的浆料白水进行染色检测，结果如表4所示。由表4可以看出，未经苯-醇抽提的白水颗粒浓度为246个/μL，平均颗粒粒径为3.28 μm，经过苯-醇抽提后白水颗粒浓度为269个/μL，平均颗粒粒径为3.24 μm。经过苯-醇抽提的和未经苯-醇抽提的漂白硫酸盐针叶木浆的白水，其颗粒浓度和平均颗粒粒径均没有明显变化。原因可能是漂白浆中的抽出物仍有部分残余会影响结果，但总体来说抽出物的影响不大，白水中仍存在一些疏水性物质可被染料选择性吸附，对检测结果造成影响。

表4 苯-醇抽提前后的白水颗粒浓度、FSC光强和平均粒径

2.3.2 细小纤维对Nile Red染色的影响

白水中由于细小纤维的存在，可能会被Nile Red 染料吸附，因此通过纤维素酶将白水中的细小纤维降解为单糖或低聚糖，以除去细小纤维的影响，随后通过流式细胞仪进行检测，纤维素酶处理前后的白水颗粒浓度、FSC 光强和平均粒径对比见表5。由表5 可以看出，经过纤维素酶处理后的漂白硫酸盐针叶木浆白水中可以被Nile Red 染料吸附的颗粒明显减少，从246 个/μL 减少到61 个/μL，其颗粒平均粒径也从3.19 μm 减少到2.98 μm。图5 为纤维素酶处理前后漂白硫酸盐针叶木浆白水FSC-FL3 图。从图5 可以看到，纤维素酶处理前检测门中有明显的被染色的颗粒，纤维素酶处理之后大部分消失。说明细小纤维的存在影响检测结果，细小纤维降解后可被染料吸附的颗粒减少，其平均粒径也有所下降。因此白水中细小纤维可以被Nile Red 染料吸附，从而激发荧光被流式细胞仪检测到，对最后检测结果造成影响。

图5 加入Nile Red染料的纤维素酶处理前后漂白硫酸盐针叶木浆白水FSC-FL3图

表5 纤维素酶处理前后的白水颗粒浓度、FSC光强和平均粒径对比

2.4 废纸浆微细胶黏物检测校正系数

细小纤维的存在会对检测结果造成影响，因此在实际应用时可提前确定校正系数。通过纤维素酶对ONP 和OCC 两种废纸浆白水中的细小纤维降解，得到如表6所示的校正系数。

校正系数计算如式（1）所示。

式中，n 为废纸浆检测校正系数，%；m 为酶处理后检测废纸浆白水的颗粒浓度，个/μL；m0为酶处理前检测废纸浆白水的颗粒浓度，个/μL。

表6 中数据表明，通过纤维素酶降解废纸浆白水中细小纤维后，其颗粒浓度有所下降，OCC浆的颗粒浓度减少到1624 个/μL，为纤维素酶处理前的83.25%，ONP 浆的颗粒浓度减少到1352个/μL，为纤维素酶处理前的86.84%。因此初步确定实验室检测废纸浆结果校正系数为85%。FSC 光强变化不大，因此其颗粒平均粒径也几乎没有变化。

表6 废纸浆微细胶黏物检测校正系数

3 结 论

本研究采用尼罗红（Nile Red）染料分别对旧报纸（ONP）浆和旧瓦楞箱纸板（OCC）浆白水、苯-醇抽提前后漂白硫酸盐针叶木浆白水、纤维素酶处理前后漂白硫酸盐白水进行染色，随后用流式细胞仪检测分析。

3.1 ONP 浆白水中颗粒浓度为1487 个/μL，颗粒平均粒径为3.20 μm；OCC 浆白水中颗粒浓度为1838个/μL，颗粒平均粒径为3.28 μm。表明染料对白水中颗粒选择性吸附，增强了废纸浆白水中疏水性颗粒的荧光性使得原先荧光性光微弱或者不显示荧光性的疏水性颗粒显示出荧光特性。

3.2 自来水中检测到颗粒浓度为62 个/μL，颗粒平均粒径为3.15 μm。表明自来水中存在能够被Nile Red 染料吸附的颗粒，废纸浆中被检测到的颗粒不全是微细胶黏物。而超纯水中几乎不含能够吸附Nile Red染料的颗粒，对最终检测结果几乎没有影响。

3.3 苯-醇抽提前漂白硫酸盐针叶木浆的白水中颗粒浓度为246 个/μL，颗粒平均粒径为3.28 μm；苯-醇抽提后漂白硫酸盐针叶木浆白水中颗粒浓度为269个/μL，颗粒平均粒径为3.24 μm，没有明显变化，表明苯-醇抽出物对检测结果无明显影响，漂白硫酸盐针叶木浆白水中仍存在可被Nile Red 染料吸附的物质；用纤维素酶降解漂白硫酸盐针叶木浆白水中细小纤维后，白水中可被检测的颗粒浓度从246 个/μL 减少到61 个/μL，颗粒平均粒径从3.19 μm 减少为2.98 μm，表明细小纤维的存在会被染料吸附并影响检测结果。

3.4 确定实验室流式细胞仪检测废纸浆颗粒浓度的结果校正系数为85%。