废水处理污泥中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性研究*

王 群 方程冉# 陈 亮

(1.浙江科技学院环境与资源学院，浙江省废弃生物质循环利用与生态处理技术重点实验室，浙江 杭州 310023；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018)

随着塑化剂邻苯二甲酸酯(PAEs)在日用品、建筑材料、医药、化妆品等生产行业的广泛应用，其在环境中的残留、分布及对生态系统的危害被日益关注[1]。据统计，PAEs在全球的年消费量高达680万t[2]，由于PAEs与化合物的结合方式为物理结合，导致其较易释放进入环境，该释放过程可发生于塑料产品的生产、使用和丢弃等过程中[3]。目前，在土壤、河水、海水、沉积物和生物群中均发现PAEs的存在[4]，其在环境中长期赋存会对生物体产生毒害效应。PAEs中应用较广泛的为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，由于其致癌性、致畸性和致突变性[5]，DBP和DEHP已被美国环境保护署列为优先控制污染物[6]。

土壤、河水、海水甚至饮用水源中的PAEs污染问题和污水的处理、排放密切相关[7]。目前，中国污水排放标准明确规定了常规生化指标和重金属含量，但PAEs等有机污染物不在其列。因此，即使污水达标排放，PAEs仍会随污水进入水环境系统，并对周围土壤造成污染。

在中国，除农用大棚和塑料薄膜的使用可直接导致PAEs污染土壤外[8]，大部分含有PAEs的塑料制品废弃物多通过垃圾堆放、填埋和后期污水处理进入环境[9]。生活、医疗和工业垃圾经过长期堆放后，PAEs可从塑料制品中释放，加上雨水的冲刷进入垃圾渗滤液。包含垃圾渗滤液在内的多种污废水是PAEs的主要汇集场所，因此只有在污水处理环节中有效去除PAEs，才能避免污水排放后PAEs对周边环境的二次污染[10]。污水处理中的生物降解是去除各类有机污染物的关键因素[11]。目前，关于污水处理系统中PAEs降解菌的多样性和PAEs对污水处理系统中微生物群落结构的影响鲜有报道。本研究系统探究了常规废水处理污泥对典型PAEs的微生物群落响应特征和污泥中PAEs降解菌的多样性，为PAEs降解菌的实际应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 污泥取样

废水处理污泥取自浙江省绍兴市某污水处理厂的好氧池，该厂长期处理化工和印染废水。新鲜污泥样经沉淀和离心去除水分后，4 ℃保存备用。

1.2 主要培养基和试剂

基础盐培养基：1.00 g/L KH2PO4，7.04 g/L Na2HPO4·12H2O，0.10 g/L MgCl2·6H2O，1 mL微量元素母液，pH 7.2。

微量元素母液：2.138 5 g/L FeSO4·7H2O，0.1 g/L ZnSO4·7H2O，0.03 g/L MnCl2·4H2O，0.3 g/L H3BO4，0.286 8 g/L CoCl2·6H2O，0.02 g/L NiCl2·6H2O，0.03 g/L Na2MoO4·2H2O，pH 4.0。

DBP、DEHP均为色谱级试剂，其他试剂均为分析纯试剂。

1.3 PAEs降解菌富集培养

针对DBP和DEHP分别进行富集培养，每组实验设置：取5 g废水处理污泥置于200 mL基础盐培养基中，添加100 mg/L DBP或DEHP作为碳源，置于30 ℃、200 r/min摇床培养5 d，转接至含有400 mg/L DBP或DEHP的基础盐培养基中继续培养5 d，再连续转接两轮(DBP或DEHP质量浓度梯度为700、1 000 mg/L)。

1.4 DNA提取和序列扩增

采用十六烷基三甲基溴化铵法[12]对样本的基因组DNA分别进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，样品DNA稀释至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行聚合酶链反应(PCR)，确保扩增效率和准确性，PCR扩增引物序列及对应区域见表1。

1.5 Hiseq测序和数据处理

使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns试剂盒构建文库，经过Qubit定量和文库检测合格后，使用Ion S5TMXL上机测序；测序数据经过Cutadapt(V1.9.1，http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)进行低质量部分剪切，再截去Barcode和引物序列后，初步得到原始数据；去除原始序列中的嵌合体序列(http://www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html)后，得到最终有效数据。

1.6 数据分析

1.6.1 可操作分类单元(OTUs)聚类和物种注释

利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)对所有数据进行聚类分析，具有97%及以上一致性的序列归为一个OTUs；用Mothur方法与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSU rRNA数据库对OTUs代表序列进行物种注释，获得分类学信息并分别在界、门、纲、目、科、属、种水平统计群落组成。

1.6.2 组间群落相似性分析

基于测序数据和OTUs聚类分析结果，使用Qiime软件计算Unifrac距离，进行非加权组平均法样品聚类分析。使用R软件的ade4包和ggplot2软件包进行主成分分析(PCA)，以反映组间群落相似性，并分别进行参数和非参数检验，检验方法选用Tukey和wilcox检验。

1.6.3 菌群丰度和系统发育多样性分析

先使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算菌群丰度指数和系统发育多样性指数。再使用R软件进行菌群丰度和系统发育多样性分析，并分别进行参数和非参数检验，检验方法选用Tukey和wilcox检验。

2 结果与讨论

2.1 DBP和DEHP降解效率

实验证明，4轮富集培养后得到的富集菌液对DBP和DEHP的降解效果较佳。富集菌液对DBP和DEHP的降解效率见图1。当DBP和DEHP为1 000 mg/L时，其在培养第6天的降解率分别达到57.1%和36.0%；经过10 d培养后，富集菌液对DBP、DEHP的降解率分别可达99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP，与文献[13]一致，而原因是DEHP含有比DBP更复杂的支链结构。

表1PCR扩增引物序列及对应区域

图1 富集菌液对DBP和DEHP的降解效率Fig.1 Degradation efficiency of DBP and DEHP by enriched bacteria solution

据报道，DBP和DEHP的降解均从酯水解开始，形成中间产物单酯(邻苯二甲酸丁酯或邻苯二甲酸乙酯)和相应的醇，单酯进一步被降解成为邻苯二甲酸[14]。由于DEHP两个酯链上各多出一个支链，导致其被降解为单酯的难度增强，是其降解速率比DBP慢的主要原因。

2.2 污泥菌群丰度及组间群落相似性分析

分别取原废水处理污泥(简称RS组)和DBP、DEHP降解菌富集培养后污泥(分别简称DBP、DEHP组)进行Hiseq测序。OTUs聚类分析发现，DBP、DEHP组中OTUs数量显著低于RS组，DBP、DEHP和RS组的OTUs数量分别为226、273和848，3个样品组共有OTUs数量为205。DBP、DEHP组中分别有90.7%、75.1%的OTUs与RS组中仅24.2%的OTUs重叠。该结果进一步表明，富集培养过程中，DBP和DEHP的添加使废水处理污泥中的微生物多样性显著降低。

本研究进一步对OTUs代表序列进行了物种注释和组间群落相似性分析，基于OTUs水平的PCA见图2。样品的群落组成越相似，则它们在PCA中的距离越接近。DBP、DEHP组物种组成相似性较高，且均与RS组差异较大。

2.3 污泥中优势菌群和PAEs降解菌的分布

基于菌群丰度分析结果，取相对丰度前10的优势门类(见表2)详细展示不同样品组的物种丰度。变形菌门和拟杆菌门在所有样品组中均占优势，且RS组中相对丰度比DBP、DEHP组中低。在RS组中，放线菌门相对丰度也较高。通过Unifrac距离分析样品间的相似性得知，DBP和DEHP组之间的物种丰度及优势门类较相似，而DBP、DEHP组均与RS组相似度较低。

图2 基于OTUs水平的PCAFig.2 PCA based on OTUs

表2 样品组间优势门类相对丰度

为探讨污泥中PAEs降解菌的分布，在DBP、DEHP和RS组相对丰度排名前35的属中选取并汇总了已被报道的具有DBP或DEHP降解能力的属，结果见表3。在DEHP组中，优势属戈登氏菌属、无色杆菌属、红球菌属、根瘤菌属和金黄杆菌属中均被报道存在DEHP降解菌；在DBP组中，优势属代尔夫特菌属、假单胞菌属和鞘脂菌属中均被报道存在DBP降解菌。戈登氏菌属、红球菌属和根瘤菌属还同时被报道存在DBP降解菌，表明许多具有DEHP降解能力的微生物菌株可能同时存在DBP降解能力；其余属不具备同时降解DBP和DEHP的能力，进一步表明DEHP比DBP更难降解，该结果和DEHP存在更复杂的支链结构相关。鉴于DEHP更难被降解，微生物如果能有效降解DEHP，则其更容易降解结构相似且没有复杂结构的DBP。系统发育多样性分析表明，已报道的PAEs降解菌存在于多种优势属中，其相互间没有明显进化关系，该结论与已报道的研究结论一致，即在自然环境中PAEs降解菌存在高度的遗传多样性[23]。以上结果表明，废水处理污泥中存在多种类型PAEs降解菌。高浓度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不断增长，进而成为优势微生物，最终达到DBP和DEHP的有效降解。但低浓度PAEs的污染仍会造成各类遗传损伤[24]。因此，在复杂的环境中去除低浓度的PAEs仍是亟待解决的重要问题。

3 结 论

(1) 废水处理污泥经过10 d培养后，对1 000 mg/L的DBP和DEHP的降解率分别可达99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP。

(2) DBP和DEHP的添加显著降低了废水处理污泥的微生物多样性；DBP、DEHP组物种组成相似性较高，且均与RS组差异较大。

(3) 废水处理污泥中存在多种类型PAEs降解菌。高浓度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不断增长，进而成为优势微生物，最终达到DBP和DEHP的有效降解。

表3DBP/DEHP降解菌的优势属分布1)

注：1)“-”表示非优势属；“+”表示优势属；“+++”表示优势属且丰度强；“Y”表示存在相应降解菌报道。