农业氮污染治理技术中脱氮菌的研究进展

潘永亮，黑 亮，黄 徐，刘 雯，蔡名旋

（1.水利部珠江河口动力学及伴生过程调控重点实验室/珠江水利委员会珠江水利科学研究院，广东 广州 510611；2.仲恺农业工程学院环境科学与工程学院，广东 广州 510225）

氮素是植物生长不可缺少的元素［1］，因此氮肥被大量投入农业生产之中。投放大量氮肥可以保证农作物产出，但是相当一部分氮肥会随着土壤流失［2］及地表水渗透［3］，造成水环境中氮污染问题。氮在水中的含量较高时，水就变成氮污染废水［4］，它不仅破坏土壤的种植能力［5］，还会导致水体富营养化［6］，使水变得腥臭浑浊，造成鱼类大面积死亡［7］，对农业生产力造成巨大影响［8］，氮元素会在人体内通过亚硝化作用转换成亚硝酸盐［9］，长期饮用氮污染水会诱发高铁血红蛋白症状和癌症［10］，对人们健康产生严重威胁。杨志辉等［11］、郑翔［12］通过数学模型计算，发现农业造成的氮污染问题已经对我国的生产效率、就业、经济衰退等问题产生了严重影响。由此可见，大量使用氮肥之后造成的氮污染废水对我们的生活产生了严重威胁，治理刻不容缓。蔡彦明等［13］、陈鸿展等［1］一致认为农业氮污染治理分为源头控制、过程削弱、污染治理3个部分。首先是投放氮肥时必须合理科学，减少氮肥浪费；其次是在污染途径中建立缓冲带，削弱氮污染浓度，最后是治理污染水体，达到治理效果［14］。但前两部分可以通过人们的行为进行控制，而重污染水体却无法自身治理，因此本文从治理氮污染废水方面进行探究，寻求农业氮肥污染废水的治理方法，减少农业工程化对我国环境造成的影响。

目前，氮污染废水处理技术主要有吹氮法、离子交换法、折点氯化法、生物脱氮法、化学沉淀法等［4］，其中生物脱氮法因其操作容易、效果相对稳定、不产生二次污染等优势，吸引着学者们的研究［15］。脱氮菌是生物脱氮技术的根本，推进脱氮菌的发展进程，对治理水体氮污染具有重要意义。自从生物脱氮技术兴起后，许多学者便致力于从不同环境中筛选出高效脱氮菌，并探究其性能，这对生物脱氮技术治理农业问题有着重要意义。本文主要从脱氮菌的脱氮机理、分离鉴定、影响因素及实际应用等方面进行综述，总结各种高效脱氮菌生存环境的相似之处，为未来高效脱氮菌的研究提供参考，并对脱氮菌的发展进行论述，对生物脱氮技术治理农业问题进行展望。

1 脱氮菌的定义及脱氮机制

1.1 脱氮菌定义

脱氮菌是指在生物脱氮过程中参与脱氮反应的菌株。脱氮过程一般可分为氨化过程、硝化过程和反硝化过程［16］，参与氨化过程的菌称为氨化细菌，参与硝化过程的菌称为硝化细菌，参与反硝化过程的菌称为反硝化细菌。但氨化过程在一般水体中均能完成［17］，因此本文对氨化细菌不予论述。

1.2 脱氮机理

脱氮菌的脱氮机理如图1所示，废水中存在以有机氮、氨氮、亚硝态氮、硝态氮等形式的氮，在反应过程中，氨化细菌会将有机物转化成NH4+；然后在有氧条件下，硝化细菌会将NH4+转换成 NO2-，再转化成 NO3-；而在缺氧条件下，反硝化细菌会将NO2-和NO3-还原成无毒害的N2［19］。

图 1 脱氮菌的脱氮机理Fig.1 Nitrogen removal mechanism of denitrifying bacteria

2 脱氮菌的分离、鉴定和脱氮效率研究

脱氮菌对环境适应能力强，生长发育时间短，对现实氮污染的治理有着重要作用。邵媛媛［19］用筛选出来的脱氮菌XP1来加强人工湿地的治理，效果十分显著，强化后的人工湿地对COD的最大去除率达到73%，对氨氮的去除率达到94%，对总氮的去除率达到78%，高氨氮污水经过治理后达到一级标准，治理时间比强化前缩短至少15 d。山东某养殖场池水氨氮严重超标，池中的虾出现了各种疾病，造成虾大量死亡，武和英［20］对此进行生物脱氮研究，投放多种菌株进入受污池水中48 h后，池水氨氮已经达到养殖标准，其中菌株DZYC02效果显著，氨氮去除效率高达96%，池水受污染的问题得到了解决；黄国鑫等［21］利用脱氮菌修复地下水，可见脱氮菌有十分可观的研究前景。脱氮菌包括硝化细菌和反硝化细菌，下面分别对硝化细菌和反硝化细菌的分离鉴定和脱氮效率进行讨论。

2.1 硝化细菌的分离鉴定和脱氮效率研究

2.1.1 硝化细菌的分离鉴定 细菌的鉴定分为形态学鉴定、生理生化鉴定和基因测定［22］。形态学鉴定就是观察菌株的状态和形态，掌握高效硝化细菌的形态规律，以识别菌株是否为硝化细菌，然后通过《伯杰细菌分类手册》进行生理生化鉴定［23］，最后通过基因测序鉴定菌株的种类。革兰氏染色法［24］是鉴定菌株中一种简单方便的方法，不仅能用来观察菌株形态，还能鉴别菌株。为了研究高效脱氮菌的规律，本文对这些高效硝化细菌的鉴定方法进行对比，由高效硝化细菌的形态学观察与革兰氏染色法的结果（表1）可知，高效硝化细菌的菌落状态多为带颜色的圆形不透明菌株，属杆状菌，革兰氏染色结果呈阴性。

表1 高效硝化细菌形态学特征与革兰氏染色结果Table 1 Morphological characteristics and Gram staining results of efficient nitrifying bacteria

2.1.2 硝化细菌的脱氮效率研究 随着生物脱氮技术的日益发展，许多学者致力于筛选出更多脱氮效果好的硝化细菌，近年来在不同环境下筛选出的硝化细菌及其脱氮效率见表2。其中，有的菌株对某个氮污染指标的去除效率特别高，有些甚至达到100%，可见其对氮污染治理有着非常好的效果。

表2 高效硝化细菌的脱氮效率Table 2 Nitrogen removal efficiency of efficient nitrifying bacteria

2.2 反硝化细菌的分离鉴定和脱氮效率研究

2.2.1 反硝化细菌的分离鉴定 由高效反硝化细菌形态学特征及革兰氏染色法的结果（表3）可知，高效反硝化菌和硝化菌的研究结果差距不大，菌株状态多为带颜色的圆形，属杆状菌，革兰氏染色结果基本呈阴性。由此可以看出，大多数脱氮菌为杆状菌，菌落状态为有颜色的圆形菌落，革兰氏染色法呈阴性。

表3 高效反硝化细菌形态学特征与革兰氏染色结果Table 3 Morphological characteristics and Gram staining results of efficient denitrifying bacteria

2.2.2 反硝化细菌的脱氮效率 许多学者从不同环境中筛选出高效反硝化细菌，其脱氮效率如表4所示。由表4可知，大多数高效反硝化菌株的脱氮效率都高于90%，有些菌株的脱氮效率甚至达到100%，也有一部分高效反硝化菌株对于氨氮及硝态氮的去除率很高，但对于总氮的去除率一般。

表4 高效反硝化细菌的脱氮效率Table 4 Nitrogen removal efficiency of efficient denitrifying bacteria

3 影响脱氮菌生长的因素

每种菌株都有其最适宜的生存环境，在最佳培养条件下，菌株的性能、活性、繁殖能力大大提升［45］，探究影响菌株生长的因素，是找到最佳培养条件的关键。研究影响脱氮菌生长的因素对废水中氮污染的治理非常重要。影响脱氮菌生长的因素有碳源、温度、溶解氧、pH、碳氮比、转速、微量元素和有毒物质等［45］。

3.1 硝化细菌影响因素

3.1.1 碳源种类 任何生物的发育都离不开营养物质和能量，脱氮菌也不例外。碳源是脱氮菌的营养物质和能量来源。王莹［33］筛选出的高效脱氮菌WY-01，分别用乙醇钠、乙酸钠、丙酸钠、丙酮酸钠、丁酸、丁二酸钠、苹果酸钠、延胡素钠和柠檬酸钠作为碳源进行研究，结果发现以丙酮酸钠和柠檬酸钠为碳源时，脱氮效果最高，达到97%；陈小岚［28］筛选出的JB4，在以乳糖、蔗糖、丙酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、乙醇、乙酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠为碳源的研究中发现，丁二酸钠为碳源时的效果最好，氨氮去除率达到86.08%；孔庆鑫［31］用二酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、柠檬酸钠作为碳源分别对YY-5进行培养，发现YY-5在含乙酸钠、琥珀酸钠的培养基中脱氮效果最好，氨氮去除率达到100%；而王娟［26］筛选出来的YS-6以碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠作为碳源时，发现以碳酸钙和碳酸氢化钠为混合碳源的效果最好，氨氮去除率达到最高（88.1%）。以上几个高效脱氮菌中的最佳碳源都不相同，而且有些菌株是单氮源，有些适合混合氮源，因此最佳碳源方面仍需进一步深入研究。

3.1.2 主要因素 除碳源外，碳氮比、温度、pH等因素都会影响到菌株的脱氮效率，因此，探究这些因素对脱氮菌的应用前景具有重要意义。从表5可以看出，几乎所有硝化细菌的适宜碳氮比都在10左右，其中YN3和YY-5适宜碳氮比较高，分别为15和14；几乎所有硝化细菌适宜温度都在30～35℃，只有耐冷菌对温度要求不一样，如M-8的最适温度为2℃；几乎所有硝化菌生存环境都为中性或弱碱性，但有的硝化菌对pH的适应范围较宽，如HN-S，它在pH为5～9之间脱氮效果都比较理想；所有硝化菌的脱氮效率都高于90%，其中YY-5的脱氮效率最佳，几乎可以完全去除水中氮污染。这些学者们筛选出的耐受能力强的菌株，不仅在培养时有更强的生命力，而且对于实际水体的耐受能力也强，更容易推进生物脱氮技术治理农业氮肥污染的进程，对生物脱氮技术的发展有着重要的意义。

表5 硝化细菌最佳条件研究Table 5 Optimal conditions for nitrifying bacteria

3.2 反硝化细菌影响因素

3.2.1 碳源种类 在反硝化细菌的研究中，碳源的作用更为强大，在反硝化反应过程中，碳源不仅为菌株提供营养物质，有机碳还为反硝化反应提供能源和电子［46］。李紫惠［39］发现的高效反硝化细菌XH02，分别使用丁二酸钠、葡萄糖、蔗糖和柠檬酸三钠为碳源进行最佳碳源的研究，发现以柠檬酸三钠为单一碳源时效果最好，对亚硝态氮和硝态氮的去除率分别为100%和94.8%；孙智毅［37］对培养出的菌株S1分别以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、延胡索钠、苹果酸钠为碳源进行研究，发现最适碳源是丙酮酸钠，18 h的脱氨氮效率达到99.1%；刘胜格［41］发现的FX-11的碳源更为广泛，以乙酸钠、葡萄糖、淀粉为碳源时，它对总氮的去除率在80%以上，但以酒石酸钾钠、柠檬酸钠、纤维素等为碳源时对总氮的去除率低于50%。

在本次研究中，我们还发现一株能以苯为碳源的菌株PDB3，它以苯为唯一碳源时，在最适条件下对苯的去除率高达100%，对总氮的去除率为52.3%［47］。这表明某些脱氮菌不仅能治理废水中的氮污染，还能治理其他污染因子，对污水治理有重要的潜在价值。

3.2.2 主要因素 从反硝化细菌最佳条件（表6）可以看出，这些反硝化菌适宜碳氮比在3.0～14.9之间，其中G16X-D适宜碳氮比最小、为3，ADH1适宜碳氮比最大、为14.9；大多数反硝化细菌最适温度在30～35℃之间，但DL-23和ADH1适宜温度较高、为37℃；这些反硝化菌适宜pH值在5.7～9.0之间，大多数都比较适应弱碱性环境，只有G16X-D可以适应酸性环境；大多数反硝化菌的脱氮效率都在90%以上，其中ZH-1的脱氮效率最高、为100%。由此可见，大多数脱氮菌的最适碳氮比在8左右，温度在30℃左右，喜欢中性或弱酸弱碱性环境，这为未来脱氮菌的培养提供了的理论依据。

表6 反硝化细菌最佳条件研究Table 6 Optimal conditions for denitrifying bacteria

3.3 其他因素

除了碳源及主要因素外，菌株生存环境其他因素（如水体中其他污染、重金属、盐度等）也会影响其生长。路泽洋［48］探究了重金属Cu和Zn对脱氮菌效率的影响，当Cu浓度为0.05 mmol/mol时脱氮效率迅速下降，Cu浓度为0.1 mmol/mol时基本丧失脱氮能力；而在Zn浓度低于0.5 mmol/mol时，Zn对脱氮反应有促进效果，但是高于0.5 mmol/mol便开始抑制。王洪娟［49］发现随着盐度增加，污水中有机物和氨氮降解速率明显降低。因此，学者们在实验室筛选出高效脱氮菌后，探究其对外界因素的耐受能力也是很有必要的。

4 脱氮菌的应用

4.1 单菌脱氮应用研究

在传统脱氮工艺上，硝化过程和反硝化过程分别在不同的反应池中进行。但随着学者们对脱氮菌的致力研究，越来越多同步硝化反硝化菌株被发现，王永红等［50］在养殖水体发现了能同步硝化反硝化的菌株j-1，在最适条件下对亚硝态氮、硝态氮和氨氮的去除率均在99%左右；白洁等［51］在沼液中发现菌株GK-1也有同步硝化反硝化能力，在最佳条件下对氨氮的去除率为99.08%，对硝态氮的去除率为96.12%。这表明具有同步硝化反硝化能力的菌株，能在同一个反应器中达到脱氮效果，大大节约了工程占地面积和成本，促进了脱氮菌工业化应用发展。

4.2 混合菌脱氮应用研究

混合菌的研究分为3种情况，第一种是硝化细菌之间的混合研究，第二种为反硝化细菌之间的混合研究，第三种是硝化菌与反硝化菌之间的混合研究。刘胜格［41］在淤泥中筛选出FX-2和FX-11两株高效反硝化细菌，FX-2在最佳条件下对总氮的去除率为73.15%，FX-11在最佳条件下对总氮的去除率为81.34%，将两个菌混合，在最佳条件下对总氮的去除率达到90%，说明菌株之间会有协同作用，在没有竞争的环境下，比单菌株的脱氮能力更强。Deng等［52］将筛选出来的高效反硝化菌SC221-M和BSC24投入养殖水体进行脱氮实验，9 d后发现BSC24的脱氮率为24.5%，SC221-M的脱氮率为26.6%，效率均非常低，但是将SC221-M和BSC24混合后投放，脱氮效率达到了53.9%，效率是单菌株的2倍。司文攻［27］将筛选出来的硝化菌HN-S和反硝化菌DN-S进行组合探究，在最佳条件下，发现两种菌组合之后脱氮能力明显加强，对总氮的去除率达到94.3%，可见，在菌株间没有竞争的情况下，混合菌的脱氮效率比单菌株要高。如图2所示，就处理水体氮污染效果而言，单一菌株＜同步硝化反硝化菌＜多种硝化细菌的复合＜多种硝化菌与反硝化菌的复合；就实用性而言，单一菌株＜同步硝化反硝化菌＝多种硝化细菌的复合＜多种硝化菌与反硝化菌的复合，但并不是所有菌株组合起来都能加强其脱氮效果，因此混合菌的应用仍需进一步探究。

5 结语

农业工程化推动了我国农业进步，大大提高了农业生产力，但背后造成的影响不可忽视，在经济发展的同时，环境治理问题仍是我国未来研究的重点。生物脱氮技术的核心是高效脱氮菌，高效脱氮菌可以从很多环境中筛选出来，如污水处理厂中的污泥、地浸场轴孔的浸出液及人工湿地的土壤等，但由于自然界的复杂性导致并不是每种菌都能适用于自然水体，而且在流动水域中菌株随水流失的影响，使脱氮菌的实际应用变得更为棘手，因此需要对脱氮菌的实际应用进行更为广泛的研究，寻找合适载体和脱氮菌固定化技术将成为未来研究的重点。

影响脱氮菌性能的因素有很多，除本文探究的因素外，还有其他因素会影响脱氮菌的脱氮效果。在已知因素方面，我们要进一步探究其影响规律和脱氮菌适宜条件规律。同时探究是否还有其他影响脱氮菌性能的因素，进一步研究脱氮菌的最佳脱氮条件。混合脱氮菌比单菌更适合应用于现实治理问题，研究各种菌之间的组合、配比，发现更多的高效菌株组合，对推动生物脱氮技术治理农业污染问题的进程有积极影响。

图2 脱氮菌实际应用效果对比Fig.2 Comparison of actual application effects of denitrifying bacteria

目前许多菌株的研究只停留在实验室阶段，并不能适用于自然水体，筛选出耐受能力更强，更符合自然环境的菌株，对治理氮污染废水具有重要意义。