HPLC法测定含藤黄不同外用制剂中的藤黄酸含量*

王 蕊，杨大宇 ，许贵军，高宏伟，吕邵娃

（黑龙江中医药大学 a.北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室；b.附属第二医院；c.附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040）

中药藤黄为藤黄科植物藤黄Garcinia hanburyi Hook.f.的树脂[1]。主产于印度、柬埔寨、泰国等地区[2]，是一味名贵的进口药材。其具有很强的消癥散结、化瘀止痛的作用，常以外用法给药。《纲目拾遗》记载其治痈疽，止血化毒，敛金疮，亦能杀虫。“在療病、痈疽、烫伤、跌打损伤、金掩肿痛、换血凝结、疔肿”等方面疗效显著，内服可做致泻剂。然而，生藤黄有大毒，主要毒性成分为藤黄酸、新藤黄酸等，也是其有效成分。现代药理研究，藤黄酸主要有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[3]。藤黄酸的不良反应主要是注射部位出现血管刺激、腹痛和恶心等[4]。目前，为了降低其毒性，一方面采用不同炮制方法，另一方面严格控制生藤黄入药剂量。然而，目前，市场上藤黄制剂中藤黄酸的含量并不明确。为此，本文采用高效液相色谱（HPLC）法测定含藤黄不同制剂中藤黄酸的含量，建立一种稳定可靠、方法和操作简单的测定藤黄酸的含量方法，为藤黄在新药剂型研发和质量控制奠定基础，为含藤黄不同制剂的质量控制和临床应用提供科学资料。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪；梅特勒AB265-S天平（Mettler-Toledo Group）；SB-5200D 型超声波清洗机（200W，40kHz），R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。

1.2 试药

藤黄（购于安因市振宇中药材饮片有限公司,经黑龙江中医药大学药学院生药教研室孙慧峰教授鉴定）；含藤黄外用制剂市售（批号：20180410，201805 21，20180618，20190306，20190716）；实验室自制贴膏；藤黄酸对照品（批号：wkq18031911，纯度≥98%四川省维克奇生物科技有限公司）；H3PO4（批号：2018 0110天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（批号：1903071西陇科学股份有限公司）；乙腈（色谱纯河北百灵威精细材料有限公司）；水为哇哈哈水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ULtimat XB-C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相乙腈-0.1%H3PO4水溶液（9 4∶6），流速1.0mL·min－1，测波长 361nm，理论板数按藤黄酸计不低于4000，与相邻峰分离度大于1.5，柱温30℃，进样量 10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取藤黄酸对照品2.002mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，即得藤黄酸对照品照品贮备溶液。

2.2.2 含藤黄外用制剂溶液的制备 取本品内容物[5]，取约 2g，加硅藻土 3g，研匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率25QW，频率33kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 实验室自制贴膏溶液的制备 取本品一贴剪碎，置烧杯中搅拌混匀，精密称定4g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇45mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，旋干，加甲醇溶液定容置25mL容量瓶中，作为供试品母液，从供试品母液中精密吸取1mL，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 藤黄酊[6]供试品溶液 将藤黄30个研碎成粉,浸泡于95%酒精70mL中,配成略带粘稠之藤黄酊。精密吸取藤黄酊10μL，置100mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.5 藤锌散供试品溶液 取藤黄细粉30g,锌氧粉70g,搅拌混匀，制成藤锌散，外用。精密称定藤锌散0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率 25W，频率 33kHz）30min，放冷,再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤1mL，置25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 专属性试验

以实验室自制贴膏的阴性对照溶液在上述色谱条件下，吸取溶液10μL进样，记录色谱图，溶液色谱中在与藤黄酸保留时间相同的位置处无干扰峰。专属性良好。色谱图见图1。

图1 藤黄酸含量测定图Fig.1 Determination of gambogic acid content

2.4 线性关系考察

精密量取藤黄酸对照品，加甲醇制成浓度为0.4000mg·mL-1的储备液，逐级稀释成系列浓度的对照 品 溶 液 使 浓 度 分 别 为 0.2000、0.1000、0.0500、0.0250、0.0125mg·mL-1置棕色量瓶中，精密吸取上述各对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，将数据进行线性回归，以峰面积为纵坐标，以标准品浓度（mg·mL-1）为横坐标，得回归方程为y=124.43x-0.4229，相关系数R2=0.9998，结果表明藤黄酸在0.1250～0.2000μg线性范围内，线性关系良好，见图2。

图2 藤黄酸标准曲线图Fig.2 Standard curve of Gambogic acid

2.5 精密度实验

取2.2.1项下对照品溶液，进样10μL，连续进样6次，藤黄酸峰面积的RSD分别为0.12%，结果见表1。

表1 精密度考察结果Tab.1 Precision inspection results

2.6 稳定性试验

取上述 4 种供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，12h，依上述色谱条件进样10μL，计算藤黄酸的RSD为0.21%～2.35%范围内，表明4种供试品溶液在12h内稳定性良好，结果见表2。

表2 稳定性考察结果Tab.2 Stability inspection results

2.7 重复性试验

取上述4种藤黄外用制剂，按2.2项下供试品制备方法制得供试品溶液（n=6），测定其中藤黄酸的RSD在1.05%～1.59%之间，表明该方法重复性良好，结果见表3。

表3 重复性试验考察结果Tab.3 Repeated test investigation results

2.8 加样回收率试验

取已知含量的含藤黄外用制剂、实验室自制贴膏、藤黄酊、藤锌散各6份，精密称定分别加入适量的对照品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。结果见表，藤黄酸的平均回收率（n=6）分别为99.97%，99.45%，98.39%，99.68%；RSD分别为1.96%，1.07%，1.46%，0.14%。

表4 加样回收率结果Tab.4 Sample recovery results

2.9 含藤黄不同外用制剂中藤黄酸的含量

取含藤黄外用制剂、实验室自制贴膏、藤黄酊、藤锌散，按2.2项下方法分别制备四种供试品溶液，按2.1的色谱条件测定藤黄酸的含量，结果见表5。

表5 含藤黄不同外用制剂中藤黄酸的含量（n=6）Tab.5 Contents of gambogic acid in different external preparations containing Garcinia cambogia（n=6）

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

本文考察甲醇-水、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%H3PO4水溶液作为流动相，乙腈-0.1%H3PO4水溶液作为流动相时分离度良好，峰型无拖尾[6]。当乙腈比例低于94%时，藤黄酸及其异构体的色谱峰分离，裂开，出现肩峰，藤黄酸没有完全分离，最终选择乙腈-0.1%H3PO4水溶液（94∶6）洗脱条件，藤黄酸分离度良好，峰形对称，保留时间适中，无杂峰干扰，检测结果准确，可靠。藤黄酸的全波长扫描最大吸收波长为361nm，该检测波长下分离度好，其他杂峰干扰小，能满足测定要求。

3.2 稳定性考察

对藤黄酸标准品进行稳定性考察时，因藤黄酸结构含多个酚羟基，很容易被氧化[1]，对照品放置12h后，发现藤黄酸不稳定，其后出现了一个小峰，同时含量降低，所以在配制标准品时应现配现用，以免藤黄酸在空气中暴露太久，被氧化变质。

3.3 提取和分离方法的选择

除回流提取方法本实验还考察了另外一种提取方法超声提取方法，结果显示回流提取法和超声提取法含量无显著性差异，但由于供试品中含有黏稠性基质，超声提取无法除去黏稠成分，进样时易吸附在色谱柱上，冲洗柱子不方便，对色谱柱伤害较大，所以本实验最终选择回流提取法。

3.4 进样量的选择

分别考察了 5、10、20、30μL 进样量，发现 20 和30μL时由于浓度过大分离度不好，藤黄酸及其同分异构体分不开，进样量10μL时峰易分开，没有肩峰现象，重现性也良好。

3.5 柱温的选择

本实验曾考察25、30℃两种柱温，柱温影响并不大，但考虑到耐用性等问题选择用30℃为柱温。

4 结论

本研究以藤黄酸为指标，对藤黄的古方外用制剂藤黄酊与藤锌散和现代医院制剂含藤黄外用制剂与实验室自制制剂的质量控制进行研究，结果表明所建立的方法简便快速，稳定可靠，能有效控制藤黄酸的使用量，用于该制剂的质量评价，以此为藤黄外用制剂的质量控制提供了科学可靠的依据。