酵子馒头与酵母馒头挥发性组分与香气特征分析

王远辉 赵靖雯 吴宵云 常永锋 张兰兰

（河南工业大学粮油食品学院 郑州 450001）

馒头是我国传统发酵面制品之一，在北方等地作为主食。馒头以小麦粉为主要原料，加入发酵剂和水及其它辅料，经过和面、发酵、压面、成型、醒发、蒸制过程制作而成[1]。经过近千年的发展和传承，不同地区的馒头制作工艺存在差别，添加的辅料也各有特色，使用的发酵剂更是多种多样，形成各种风味独特的、地域特色鲜明的馒头[2]。形成不同类型馒头风味的主要阶段是发酵过程，而我国传统馒头制作工艺使用的是先辈们长期探索，祖辈相传的传统发酵剂，例如老面、面起子、面肥、酵子、渣头等[3]。传统发酵剂制作的馒头在我国历史悠久，百姓对此类馒头已形成深刻的风味记忆。从20 世纪80 年代开始，国外常用于面包发酵过程的即发干酵母传入我国，由于其发酵力强，产气量大，发酵时间短的优势，迅速在大规模制作馒头时广泛使用，渐渐替代了我国的传统发酵剂[4]。酵母馒头的制作工艺简单、成本低，占据主流市场。然而，酵母制作的馒头风味不佳，百姓普遍评价为没有“馍味”[5]。近些年，随着居民消费水平的提高，传统发酵剂制作的馒头受到更多消费者的亲睐，逐渐出现在超市、卖场、馒头坊等。酵子作为我国传统发酵剂之一，在河南、河北、山东等中原地区民间使用，因其加工过程较老面简单，适合大规模生产，故有馒头厂开始尝试工业化生产酵子馒头[6]。

酵子馒头香味独特，与酵母馒头的嗅觉感受差异明显，需对两种馒头的挥发性物质进行全面的分析，为明晰酵子馒头香气组分奠定基础。研究食品的挥发性物质主要分为两部分，第1 部分是挥发物的收集，常用方案有利用挥发油收集器和克莱文革装置（Clevenger apparatus）经蒸馏方法收集，利用吹扫捕集（PT）、同时蒸馏萃取（SDE）、顶空固相微萃取（HS-SPME）等技术[7-9]；第2 部分是对收集到的挥发物进行定性和定量分析，利用气相色谱（GC）分离结合质谱（MS）、红外谱图（IR）、核磁图谱（NMR）、气相保留指数（LRI）、标准品对照等手段对数量较多的挥发物进行定性分析，利用相对百分含量、内标半定量、内标法和外标法定量等方法进行定量分析[10-12]。大量研究用HS-SPME-GC/MS 对馒头的挥发性物质进行分析，是由于HS-SPME 的操作过程较简单、快捷，利用质谱图比对进行定性分析，使用峰面积归一化法表示挥发性物质的相对含量[13-14]。然而，HSSPME 适用于收集低沸点、易挥发的物质，对于挥发物收集不完整，仅用质谱图比对定性是不严谨的，至少同时使用两种定性方法。为分析酵子馒头和酵母馒头的挥发性物质，本文使用SDE 和HSSPME 收集两种馒头的挥发性物质，使用MS 和LRI 两种方法对两类馒头中的挥发性物质进行定性分析，通过加入内标的半定量方法分析挥发性物质含量，利用气相嗅闻（GC-O）技术分析两类馒头的香气特征。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

小麦粉（特一等），郑州金苑面粉厂；酵子，南阳菜市街传统酵子门市部；酵母、食用碱，安琪酵母股份有限公司。

正己烷（色谱纯）、无水乙醚（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；正构烷烃混标（C7-C30，≥97%），美国Supelco；2-甲基-3-庚酮（99%），阿拉丁；氮气（纯度99.999%），河南科益气体股份有限公司。

SM-25 和面机，新麦机械有限公司；YM600自动连续压面机、电汽两用蒸柜，鼎海精机大丰有限公司；ZJ350L 切面机，济南御厨食品机械有限公司；HWR-080 恒温恒湿箱，上海烨昌食品机械有限公司；同时蒸馏萃取装置、吹扫捕集装置，自行设计后用玻璃制作；7890A-5975C 气质联用仪（GC/MS），配备嗅闻（Olfactometry）模块，美国Agilent 公司；固相微萃取装置（DVB/CAR/PDMS 50/30 μm），美国Supelco。

1.2 试验方法

1.2.1 馒头的制作 酵子馒头参照本团队前期使用的二次发酵法制作[15]，酵母馒头参照本团队前期使用的酵母馒头制作方法[16]。

1.2.2 同时蒸馏萃取法（Simultaneous distillation extraction，SDE）同时蒸馏萃取（SDE）装置根据本团队前期的改进设计并使用玻璃制作[15]。称量100 g 馒头样品，装入蒸馏器中，以80 mL 无水乙醚作为萃取液，蒸馏60 min，再通过分馏、旋蒸、氮吹进行浓缩，并置于-18 ℃密封储藏备用。以GC/MS 测定的挥发物总峰面积，评价浓缩方式对收集效果的影响。

1.2.3 顶空固相微萃取（Headspace solid phase microextraction）精确称量馒头样品3 g，装入30 mL 顶空瓶中，使用萃取纤维头（DVB/CAR/PDMS 50/30 μm）进行顶空萃取，然后直接将纤维头插入GC/MS 中测定，对萃取条件中吸附温度、吸附时间、解吸时间进行优化，以测定挥发物的总峰面积评价萃取效果。

1.2.4 气-质谱联用（GC/MS）气质分析使用Agilent 7890A-5975C 组成的气质分析系统，色谱柱分别使用DB-5 和DB-WAXETR 色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm，美国J&W Scientific）。检测得总峰面积的大小表示样品中所含化合物的浓度高低。使用DB-5 色谱柱分析时，色谱条件如下：进样量：1 μL；不分流模式；进样温度：250 ℃；升温程序：40 ℃保持2 min，3 ℃/min 升温至50 ℃保持1 min，继续以5 ℃/min 升温至110 ℃保持1 min，再以6 ℃/min 升温至250 ℃保持1 min，再300 ℃保持10 min；载气：氦气（99.999%）；流速：1.0 mL/min。

使用DB-WAXETR 色谱柱分析时，色谱条件与DB-5 色谱柱不同之处是升温程序，如下：40℃保持2 min，3 ℃/min 升温至50 ℃保持1 min，继续以5 ℃/min 升温至110 ℃保持1 min，再以6 ℃/min 升温至250 ℃保持1 min，再250 ℃保持10 min。

质谱条件：电子电离源；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；连接线温度：280 ℃；质谱温度：150 ℃；质谱扫描范围：30～550 u。

1.2.5 定性与定量分析 挥发性物质的定性分析使用两个方案：（1）质谱比对，利用气质联用仪配套的Wiley 和NIST 数据库和Adams 的记录[17]进行比对；（2）气相保留指数（LRI）匹配，利用正构烷烃（C7-C30）计算检测到化合物的LRI 值，与NIST数据库和Adams 的记录进行匹配。以2-甲基-3-庚酮作为内标，对挥发性物质的含量进行半定量分析。

1.2.6 气相嗅闻（GC-O）分析 使用GC-O 对收集的两类馒头挥发性物质进行分析，选择6 名受过训练的感官评价员组成小组，记录样品的味道特征和强度，进行嗅闻分析。嗅闻分析员由3 名男性和3 名女性组成，年龄不同。在试验过程中，至少两个嗅闻分析员可以同时得到相同的感官描述，才记录并报告。气相分离参数与GC-MS 分析设置相同。

1.3 数据处理

所有测定都平行测定3 次，以平均值±标准差表示。使用SPSS 19.0 软件进行ANOVA 分析（P＜0.05），分析其显著性差异，使用Origin 2016 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 同时蒸馏萃取

同时蒸馏萃取（SDE）方法将蒸馏与萃取结合，并使两个过程同时完成，从气态到液态冷凝的过程中进行萃取，常用于挥发性物质的收集[18]。已有研究发现馒头中挥发性物质丰富，挥发物多达数十种[19]。使用前期优化得到的SDE 参数[15]，为提高萃取液中挥发物浓度，通过分馏、旋蒸、氮吹的方式对萃取液进行浓缩，结果见图1。经过浓缩处理后萃取液挥发物的总峰面积显著增加（P＜0.05），以分馏、旋蒸、氮吹一起使用时效果最佳。胡丽花[20]、张国华[9]在分析馒头挥发性物质时也曾使用旋蒸和氮吹的方式浓缩SDE 萃取液。SDE 萃取液适合浓缩，可能是由于SDE 运行温度较高，萃取挥发物多为高沸点化合物，在浓缩时损失较少。

图1 不同浓缩处理方式对SDE 萃取液挥发物含量的影响Fig.1 Effects of different concentration methods on the content of volatile composition in SDE extract

2.2 顶空固相微萃取

顶空固相微萃取（HS-SPME）是目前最常用的收集挥发物的技术，操作简单、富集量高、无损伤，研究馒头挥发物时也大量使用HS-SPME，部分研究人员甚至仅仅使用这一项技术[21]。根据已有研究，使用萃取纤维头（DVB/CAR/PDMS 50/30 μm），对萃取过程中吸附时间、萃取温度和解吸时间进行优化。由图2a 可知，挥发物含量随着萃取温度的增加先升高后降低，达到55 ℃时吸附挥发物含量最大；图2b 显示，随着吸附时间的延长，吸附挥发物含量先增加后降低，吸附30 min 时效果最好。将萃取纤维头插入GC/MS 进样口后开始解吸，解吸时间不同，测得挥发物含量不同，当解吸6 min 时，测得挥发物含量最高（图2c）。综上，HSSPME 的最适操作条件是萃取温度55 ℃，吸附时间30 min，解吸时间6 min，以此参数萃取酵子馒头与酵母馒头的挥发物，并进行分析比较。

2.3 酵子馒头与酵母馒头的挥发性物质分析

利用SDE 和HS-SPME 收集酵子馒头（JSB）和酵母馒头（YSB）的挥发性物质，通过质谱图（MS）与气相保留指数（LRI）比对定性分析，结果见表1。JSB 由HS-SPME 和SDE 收集挥发性物质种类分别为41 种（相对含量91.07%）和22 种（相对含量98.12%），YSB 由HS-SPME 和SDE 收集挥发性物质种类分别为40 种（相对含量93.29%）和33 种（相对含量98.86%）。由此可知，HS-SPME收集两种馒头的挥发性物质种类较SDE 多，已有研究发现HS-SPME 更适合收集沸点低、挥发性强的化合物，富集能力强，然而其重现性和稳定性稍差[22]。试验中HS-SPME 收集挥发物中可定性识别的化合物相对含量较低（约为93%），SDE 收集挥发物中可定性识别的化合物相对含量达到98%以上，说明HS-SPME 的吸附和富集能力强，然而吸附非目标物较多，不利于定性识别；而SDE 吸附种类虽少，但是定性分析的识别度高，利于分析。

图2 不同操作参数对顶空固相微萃取收集酵子馒头挥发物的影响Fig.2 Effects of different operating parameters on HS-SPME for collecting volatiles from Jiaozi steamed bread

JSB 和YSB 共有化合物有23 种，共有化合物中HS-SPME 收集JSB 挥发物相对含量为66.09%，收集YSB 挥发物相对含量为49.34%；SDE 收集JSB 挥发物相对含量为81.94%，收集YSB 挥发物相对含量为28.24%；其中共有醇类7 种，醛类6种，酮类2 种，酯类2 种，含苯环类2 种，杂环类2种，烷烃类1 种。两种馒头中挥发物含量的整体差异巨大，JSB 独有化合物26 种，HS-SPME 和SDE收集化合物的相对含量分别为25.65%和15.50%；YSB 独有化合物40 种，HS-SPME 和SDE 收集化合物的相对含量分别为44.11%和70.46%。

从化合物种类的差异看，JSB 和YSB 含有相对含量较高的醇类化合物，HS-SPME 收集挥发物中，YSB 含有醇类化合物相对含量（32.08%）比JSB 多；SDE 收集挥发物中，JSB 含有醇类化合物相对含量（79.35%）较YSB 多，JSB 中乙醇的相对含量高达63.75%，YSB 中未测到。两种收集方法中，YSB 中醛类化合物相对含量较JSB 高近1 倍，主要是己醛、壬醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-十三烯醛的相对含量较高。醚类化合物中，两种馒头所含化合物完全不同，YSB 中相对含量较高。YSB 中酮类化合物相对含量比JSB 高近1 倍，主要是香叶基丙酮和2-羟基-3-丁酮。两种馒头中所含酸类化合物完全不同，JSB 中酸类化合物相对含量远高于YSB，其中SDE 收集的十六酸相对含量达到9.17%。HS-SPME 收集的YSB 中酯类化合物相对含量达到19.55%，远高于JSB 中含量（2.91%），主要是2-辛烯酸甲酯、水杨酸-2-乙基己基酯和胡莫柳酯。HS-SPME 收集JSB 中含苯环类化合物相对含量较YSB 高近1 倍，JSB 所含的甲氧基苯基肟相对含量达到18.06%。HS-SPME 收集JSB 中杂环类化合物相对含量较YSB 高近1 倍，JSB 中萘相对含量达到20.98%。HS-SPME 收集JSB 中烷烃类化合物相对含量较YSB 高近1 倍，JSB 所含的姥鲛烷、5-丙基十三烷和正十六烷相对含量较高。SDE 收集YSB 中烯烃类化合物相对含量较JSB 高10 倍，YSB 中巴伦西亚橘烯相对含量高达31.68%。

2.4 香气特征分析

酵子馒头具有明显而独特的香味，消费者常认为JSB 较YSB 具有明显的醇香味[21]。利用气相嗅闻技术（GC-O）对JSB 和YSB 的香气特征进行分析，挥发物中在嗅闻时被识别出香气特征的化合物为45 种，其中醇类、醛类、酯类化合物的香味特征比较明显，其中醇类化合物给予馒头香气特征；而醛类、醚类、酯类、酮类、烯烃类化合物含量少，阈值低，对香味贡献较少；烷烃类化合物在嗅闻时未被识别，对馒头香味无贡献。在JSB 中，醇类化合物的相对含量明显高于YSB，乙醇相对含量高，主要贡献醇香、酒香味；酸类化合物赋予JSB 酸味特征，尤其是十六酸；杂环类化合物中萘也对JSB 贡献较多的辛辣味；含苯环类化合物虽然含量较低，但是阈值较高，主要赋予JSB 坚果香和烤花生香味。在YSB 中，醇类化合物含量虽较高，但其含量不如JSB 高，故其醇香味稍弱；YSB含量稍高的醛类、酮类、酯类化合物主要贡献花香和果香，然而其香味表现弱，在馒头整体香气特征中表现不明显；YSB 中芳香族化合物的含量较低，香味贡献较低。所以，JSB 与YSB 相比，表现出易于识别的、香味独特的香气特征，而且香味受到消费者的喜爱和认可。

3 结论

酵子馒头常常被认为比酵母馒头更具浓郁香气，主要是挥发性物质的作用。经过分馏、旋蒸、氮吹后发现，SDE 萃取液适合浓缩后再通过GC/MS分析。对HS-SPME 收集挥发物进行GC/MS 分析后，发现SDE 与HS-SPME 对两种馒头的挥发性物质表现出不同的收集效果。利用GC-O 对收集的挥发性物质的香气特征进行分析，识别两种馒头的香气特征。两种馒头共有挥发性组分23 种，JSB 中共有组分相对含量较高（＞60%），而YSB 中相对含量较低（＜50%）。两种馒头的挥发物差异明显，JSB 中醇类、酸类、含苯环类、杂环类、烷烃类化合物相对含量高，其乙醇相对含量达到63%，酸类和芳香族类化合物具有较低阈值，故JSB 具有浓郁香气，表现出醇香、果香和坚果香味。YSB 中醇类化合物相对含量较JSB 低，且芳香族化合物香气贡献低，故YSB 的香味不如JSB 浓厚。未来可对酵子馒头制作过程中香味化合物的变化规律进行深入分析，从而发现酵子馒头等传统发酵剂所制作的馒头香味根源，并解析其呈香过程。