微波辅助柚皮苷非水相酶促反应及对HepG2 细胞的抗增殖影响

姜丽艳，赵 博，王 智，陈启瑞，李玥莹，闫国栋

1.吉林大学生命科学学院，吉林 长春 130012

2.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，吉林 长春 130012

柚皮苷是一种天然的双氢黄酮类化合物，药理作用广泛，具有抗过敏、抗炎、抗氧化、降血脂、抑癌、促进骨细胞增殖和分化等多种生物活性[1]。ZAAT 等[2]发现，柚皮苷可以显著延长小鼠的睡眠时间，说明柚皮苷具有镇静、安神的作用。另外的研究[3]发现，柚皮苷能促进小鼠MC3T3-E1 细胞、小鼠原代培养成骨细胞、人原代培养成骨细胞和人骨髓间充质干细胞等多种成骨细胞的增殖和分化。KANNO 等[4]发现柚皮苷可以显著降低由冈田酸引起的细胞凋亡作用，而且对MCF-7、MDA-MB-231肺癌细胞，KATOIII、MKN-7 胃癌细胞，HepG2、Hep3B、Huh7 肺癌细胞，Hela、Hela-TG 子宫癌细胞，TNBC 乳腺癌细胞，PK-1 胰腺癌细胞，Caco-2 结肠癌细胞和HL-60、NALM-6、Jurkat、U937 白血病细胞的增殖都呈现一定的抑制作用[5]。但柚皮苷分子中存在多个酚羟基，化学性质不稳定，脂溶性差，不易透过双脂层细胞膜，难以到达靶向作用点而大大降低其应有的生理活性[6]。

为了提高柚皮苷的稳定性及其生理活性，一些物理化学方法[7]被用于改善柚皮苷的溶解性和利用度。研究报道利用非水相酶促催化技术对柚皮苷进行衍生化的修饰研究，能够提高柚皮苷的稳定性，但催化体系的酶活不高，而且催化反应的效率低[8]。微波辐射作为一种安全、绿色的加热能源，已经被广泛的应用于酶催化的各个领域[9]。本研究将非水相酶催化技术与微波能源偶联应用于乙酰化柚皮苷的制备，并优化柚皮苷非水相酶促乙酰化反应过程，同时探索乙酰化柚皮苷对HepG2 细胞的抗增殖作用。

1 实验部分

1.1 微波辅助柚皮苷非水相酶促乙酰化催化反应

采用商业多功能微波反应器（MCR-3 型，上海JieSi 微波化学公司）完成微波辅助催化。将反应物（98%的柚皮苷，武汉福德化工有限公司）0.2 mmol、酰基供体4 mmol、有机溶剂20 mL 和黑曲霉固定化脂肪酶ANL（99%，丹麦Novo 公司）550 mg 置于磨口三角瓶中，旋转搅拌磁板和磁力搅拌棒对反应混合物进行混合，控制不同的微波功率、微波设置温度和微波条件下水活度（aw），监控反应混合物的温度，反应设定时间后取样检测，反应结束时将酶过滤终止反应，并将溶剂旋转蒸干。所有的实验重复三次（n=3）。

柚皮苷的非水相酶促乙酰化反应如下所示。

反应进程通过反相薄层色谱（RPTLC）和Waters 600 高效液相色谱（HPLC）检测。RPTLC 分析时，样品点在Kieselgel 60 RP-18 F254 板上，利用三氯甲烷/甲醇（体积比为3:1）展开剂展开，在UV 254 nm 下检测柚皮苷及其衍生物的反应进程。HPLC 操作条件：Thermo C18（4.6 mm × 250 mm × 5 μm，Agilent，USA）色谱柱；流动相是水（A）和甲醇（B），0～5 min 40%～80%(B)，5～15 min 维持80%(B)，15～25 min 80%～40%(B)；流速1.0 mL/min。柱温30 °C，进样量为10 µL；检测波长为330 nm，柚皮苷及其乙酰化产物的保留时间分别为8.695 min 和10.474 min[10]。

1.2 水活度的设定

所有反应试剂在133 Pa 真空条件下预干燥12 h，在反应混合物中加入适量水维持一定的水活度。采用水活度测定仪（Aqualab 4TE/TEV，上海君翼仪器设备有限公司）进行实时测量。

图1 VC 标准曲线Fig.1 The standard curve of VC

1.3 柚皮苷及其酶促衍生物的体外抗氧化作用

（1）总抗氧化能力的测定-钼酸铵法[11]

分别配制0.1 mg/mL 的柚皮苷和乙酰化柚皮苷衍生物的两种溶液，和0.01～0.09 mg/mL 的维生素C（VC）溶液，将0.3 mL 待测物加入到3 mL 的钼酸铵中，将混合液混匀并于95 ℃恒温水浴90 min，反应液冷却后，于695 nm 处测定吸光值，总抗氧化能力VC与吸收强度A695的标准曲线见图1。

（2）铁离子还原能力的测定-FRAP 法[12]

分别配制0.05 mg/mL 样品溶液，2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）（无水乙醇）和VC溶液（超纯水）三种溶液，于10 mL 试管中加入一定量的待测物，再加入2 mL 铁离子还原能力（FRAP）工作液，振荡摇匀，37 ℃下静置10 min，测定593 nm 处吸光值。

1.4 亲脂性实验

采用油水分配系数方法检测柚皮苷和乙酰化柚皮苷的亲脂性[13]。在500 mL 的磨口锥形试剂瓶中加入等体积的正辛醇和去离子水，30 °C 下恒温振荡24 h，然后于分液漏斗中室温静置24 h，实验时取上层辛醇相和下层水相作为饱和溶剂。称取柚皮苷或乙酰化产物1 mg，溶于5 mL 的预饱和正辛醇溶液，混合均匀，作为样品贮备液。取0.6 mL 样品贮备液，加入4.4 mL 预饱和正辛醇溶液，测定其280 nm 处的吸光度值为（A0），再加入预饱和的水溶液，旋涡震荡1 min 后室温静置24 h，测其上层正辛醇相的吸光度值为（Ax）。计算正辛醇/水分配系数logP：logP=logAx/(A0-Ax)。

1.5 检测HepG2 细胞的抗增殖作用[14]

取对数生长期的HepG2 细胞（中国科学院上海细胞库）至离心管内，调整细胞的浓度为5×104个细胞/mL，每孔100 μL 接种于96 孔细胞培养板中培养过夜，保证细胞状态良好，贴壁正常；用完全培养基配制柚皮苷及其衍生物母液，过滤除菌，再分别稀释，药物作用72 h，每一个实验组均设置三个重复孔；药物作用结束后，无菌条件下加入20 μL 的噻唑蓝（MTT）溶液，在5%的CO2培养箱中孵育4 h；加入0.15 mL 的二甲基亚砜（DMSO）溶解产生的蓝紫色晶体，在492 nm 波长条件下测定光吸收值即OD 实验值，纯HepG2 细胞的吸光度值为OD 对照值。IC50为抑制率50%时的药物浓度。

计算细胞抑制率(%)=（1-OD 实验值/OD 对照值）×100%

2 结果与讨论

2.1 微波辅助柚皮苷酶促乙酰化反应条件优化

2.1.1 微波功率对柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的影响

在水活度为0.60、微波设置温度为40 ℃的条件下，不同微波功率下柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的实验结果见图2。从图2 可以看出，当微波功率从100 W 逐渐增加时，柚皮苷酶促乙酰化反应的酶活开始增加，当微波功率为400 W 时，酶活达到最高，为(306±5) μmol/(h·g)；如果继续增加微波功率，酶活却明显下降。这可能是因为大功率的微波致使酶蛋白的过度裸露，从而引起酶结构过于松散，破坏酶的立体构象，导致脂肪酶ANL 的失活[15]。400 W 为本实验的微波最佳功率。

图2 微波功率对ANL 酶活度的影响Fig.2 Effect of microwave power on ANL enzyme activity

图3 微波温度对对ANL 酶活度的影响Fig.3 Effect of microwave temperature on ANL enzyme activity

2.1.2 微波温度对柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的影响

同样地，固定微波功率为400 W，水活度为0.60 的条件，考察了不同微波温度（由微波处理时间）时脂肪酶ANL 催化柚皮苷乙酰化的反应，结果如图3 所示。图3 显示当微波温度从30 ℃逐渐升高到70 ℃时，ANL 酶活逐渐增加，且在70 ℃时酶活达到最大值，为(460±6) μmol/(h·g)，但当温度从70 ℃继续升高到90 ℃时，酶活却呈明显下降趋势。因为当温度在一定范围内逐渐升高时，增加了酶分子之间的接触机会，进而使酶活提高；但当温度过高时，破坏了酶分子的原有构象，导致酶活降低[16]。70 ℃为本实验的最适微波温度。

2.1.3 水活度对柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的影响

在微波功率位400 W、微波温度为70 ℃的条件下，考察了不同水活度（aw）下的柚皮苷酶促乙酰化反应，结果如图4 所示。从图4 可以发现，随着aw的不断增加，柚皮苷酶促乙酰化反应的酶活也逐渐增加，且在aw为0.80 时酶活性达到最大值，为(612±10) μmol/(h·g)；但当aw继续增加时，酶活性呈明显下降趋势。所以，aw为0.80 是ANL 催化柚皮苷乙酰化反应的最适水活度。

图4 水活度对ANL 酶活度的影响Fig.4 Effect of water activity on ANL enzyme activity

图5 微波加热处理下脂肪酶ANL 的稳定性Fig.5 Reusability of ANL under microwave irradiation

2.1.4 微波加热处理下脂肪酶ANL 的稳定性

实验考察了微波加热条件下脂肪酶ANL 被回收重复使用的活性，即ANL 活性的稳定性，结果如图5 所示。图5 结果表明，在微波功率为400 W，加热温度为70 ℃，aw为0.80 的条件下，脂肪酶ANL反复使用十个反应周期后，活性下降的并不明显，表明在此功率微波辐射下，脂肪酶ANL 具有较强的稳定性。

2.2 柚皮苷及其酶促衍生物的结构鉴定

利用RPTLC 和HPLC 监测柚皮苷非水相乙酰化反应过程，发现2 h内的转化率为（90.42±2.43）%，说明该催化反应进行较好。经核磁共振谱仪（AC500，Bruker）1H 和13C 对产物检测，结果如下：

1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12.06 (d, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.33 (d, 2H), 6.81 (s, 2H), 6.12 (d, 1H), 6.07(d, 1H), 5.55-5.41 (m, 3H), 5.18 (dd, 1H), 5.10 (d, 1H), 4.74 (d, 2H), 4.27 (d, 1H), 4.04 (dd, 1H), 3.76-3.67(m, 3H), 3.49 (d, 2H), 3.36 (s, 3H), 3.23-3.15 (m, 2H), 2.72 (dd, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.24 (s, 3H)。

13C NMR (500 MHz, DMSO) 18.5, 42.6, 63.7, 68.8, 70.4, 70.8, 70.9, 72.3, 74.1, 77.4, 79.3, 95.7, 96.8,97.7, 101.0, 103.8, 115.6(2C), 128.9, 129.0, 129.1, 158.3, 163.3, 165.0, 170.6, 197.8。

表明柚皮苷非水相乙酰化反应的衍生物为6′-乙酰化柚皮苷。可见ANL 酶催化柚皮苷乙酰化反应具有高度的位置选择特异性。

2.3 柚皮苷及其酶促衍生物的体外抗氧化活性实验

2.3.1 柚皮苷及其6′-乙酰化柚皮苷的总抗氧化能力总抗氧化能力（TAC）的测定运用的是钼酸铵法，即抗氧化物质可以将Mo（Ⅵ）还原为Mo（Ⅴ），并且在酸性条件下形成绿色Mo（Ⅴ）的磷酸盐。根据Vc 曲线（图1）可确定浓度为0.1 mg/mL 时，每mg 样品的总抗氧化能力柚皮苷为（0.036±0.00193） mg-VC/mg，6′-乙酰化柚皮苷为（0.033±0.00169）mg-VC/mg。表明柚皮苷及6′-乙酰化柚皮苷具有较强的总抗氧化能力，6′-乙酰化皮苷的总抗氧化能力较母体略有下降。分析原因可能是多酚类化合物的总抗氧化能力根源于其多酚羟基的化学结构特点，6′-乙酰化柚皮苷是柚皮苷果糖C-6′的羟基被乙酰基替代，分子结构中少了一个羟基，所以6′-乙酰化柚皮苷的体外总抗氧化能力略下降。

2.3.2 柚皮苷及其6′-乙酰化柚皮苷的铁离子还原能力

在低pH 的溶液中，有抗氧化剂存在时，Fe3+-三吡啶三嗪（Fe3+-TPTZ）被还原成Fe2+-三吡啶三嗪（Fe2+-TPTZ），反应液则变成深蓝色，在593 nm 处有最大吸收，吸光度愈高表示还原能力也越强。图6所示为柚皮苷及其6′-乙酰化柚皮苷溶液的吸光度。可知，随着样品浓度的增加，吸光度值逐渐升高，即铁离子的还原能力逐渐升高。柚皮苷的铁离子还原能力很强，与VC相近；与柚皮苷母体相比，6′-乙酰化柚皮苷的铁离子还原能力略下降。

图6 不同浓度柚皮苷、6′-乙酰化柚皮苷和VC 的铁离子还原能力Fig.6 Dose-dependent ferric reducing ability of naringin,6′-acetylated naringin and VC

2.4 柚皮苷及其酶促衍生物的亲酯性能

利用正辛醇/水的分配系数（logP）对柚皮苷及其乙酰化产物的亲油性进行实验研究，实验结果见表1（logP 的值越高表明该化合物的亲油性越高）。

表1 柚皮苷及其乙酰化产物的正辛醇/水分配系数结果(25 °C)Table 1 Results of the Octanol/water partition coefficient of naringin and its acetylated derivative

由表1 可以看出，柚皮苷的乙酰化产物和柚皮苷底物相比显示了较高的亲油性，亲酯能力比底物提高了大约65%。这可能是因为柚皮苷的果糖6 位-羟基被乙酰基取代，提高了乙酰化产物的亲油性。该实验结果也可以通过柚皮苷及其乙酰化产物的在HPLC 的出峰时间观察到，柚皮苷的乙酰化产物出峰时间要远大于柚皮苷。柚皮苷乙酰化产物亲油性的提高，增加了其进入磷脂双分子层细胞膜的机会，及有可能增强其体内细胞活性。

2.5 柚皮苷及其酶促衍生物对HepG2 细胞抗增殖性能

图7 柚皮苷对HepG2 细胞抗增殖的影响Fig.7 The inhibitory effects of naringin on HepG2 cell viability

当使用柚皮苷及其酶促乙酰化衍生物对HepG2 细胞作用72 h 后，不同浓度的柚皮苷及其酶促乙酰化衍生物对HepG2 细胞呈现不同趋势的生长增殖抑制作用，结果见图7。可以看到，随着柚皮苷及其酶促乙酰化衍生物浓度的不断增加，对HepG2 细胞的生长增殖抑制作用逐渐加强。当柚皮苷及乙酰化柚皮苷浓度使用为2.0 mmol/L 时，乙酰化柚皮苷对HepG2 细胞的生长增殖抑制率为80%（细胞生长增殖显著程度p 小于0.05），IC50值为0.825 mmol/L，而柚皮苷对HepG2 细胞的生长增殖抑制率仅为48%，IC50值为1.35 mmol/L，乙酰化柚皮苷较母体柚皮苷相比表现了更好的HepG2 细胞生长增殖抑制作用。

3 结 论

微波辅助技术成功催化了柚皮苷的非水相酶促乙酰化反应，在微波功率为400 W，微波温度为70 ℃，水活度为0.80 时反应的脂肪酶ANL 最高酶活为(612±10) μmol/(h·g)，比传统方法提高4 倍左右。不仅提高了非水相反应的反应速率，而且提高了酶的位置选择性。分析认为微波辐射和酶催化偶联时能够显著提高酶的作用环境，影响酶活性中心和底物的诱导及契合作用，增加底物的反应基团和酶的活性位点结合机会，进而提高了反应体系的反应速度，增强了酶的催化专一性。虽然乙酰化柚皮苷较柚皮苷母体相比体外抗氧化性略降低，但乙酰化柚皮苷的亲脂性有所提高，可能会增加其进入磷脂双分子层细胞膜的机会，进而对HepG2 细胞具有较强的抗增殖能力。