肝素结合蛋白对脓毒症相关急性肾损伤诊断的初步探讨

刘玲玲，胡仁静*，李玉生，崔 燕，马致远，范沁榕

（无锡市第二人民医院检验科，江苏 无锡 214000）

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是重症疾病患者常见的急性并发症，这种严重的器官功能障碍有很高的发病率和死亡率，在形成脓毒症的患者中尤为常见。临床和实验工作的重点是确定哪些患者有可能发展成为AKI，以便在器官损害导致终末期肾病之前采取充分的措施。血清肌酐或尿量是肾损伤的晚期标志物。已经有许多用于早期检测AKI的生物标志物如NGAL、IL-18、KIM-1、IGFBP7、TIMP-2、DDRGK1等[1]，但到目前为止还没有进入临床实践。生物标志物通常只代表肾细胞损伤的指标[2]。相反，参与诱导破坏性的分子更重要的是要识别。最重要的是灭活和消除这些主要源于内源性生产的有毒化合物。在这些对肾微血管结构和近端小管造成损害的分子中，有白细胞介素和蛋白酶以及中性粒细胞胞外陷阱(NET)等[3-4]。它们大都是从效应细胞中分泌出来的，并对入侵的病原体进行消除。这些效应细胞包括淋巴细胞和粒细胞等，前者抗病毒感染和杀伤肿瘤细胞，后者主要作用于细菌和真菌。肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)，是活化的中性粒细胞相关的囊泡中持续产生的，已被证明是脓毒症严重程度的重要决定因素。此外，在小鼠模型中，高浓度的HBP已被证明通过间质富集蛋白质聚集和间质出血导致肾损伤，提示血管损伤增加[5]。HBP被认为是脓毒症的预测指标，HBP通过增加内皮通透性，增强炎症状态和细胞周期阻滞，在AKI发病中起重要作用。因此，本实验旨在研究脓毒症AKI患者血浆中HBP的水平，并初步探讨其对于AKI分期的诊断意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年1月至2020年6月期间来无锡市第二人民院就诊的90例18岁以上符合脓毒症标准的门诊病人的血液样本，排除标准是18岁以下艾滋病毒或丙型肝炎病毒等传染病患者。从90例患者中采集静脉血样，45例有AKI的脓毒症患者作为实验组，45例性别和年龄匹配的无AKI的脓毒症患者作为对照组。采血后30min内离心取血浆-70℃储存。并记录90例患者的年龄，性别，C反应蛋白数值，白细胞计数数值，血液肌酐的数值，24小时尿量等数据。

1.2 仪器与试剂

本科室所用iMark 酶标仪（美国伯乐公司），洗板机（郑州新科技有限公司），肝素结合蛋白测定试剂盒（中翰盛泰器械有限公司）。

1.3 实验方法

加100μL校准品A-F、质控品和实验样本至酶标板相应的孔中，18-25℃孵育60分钟，洗板机洗涤三次后加入100μL酶结合物，18-25℃孵育60分钟，洗涤三次后加入100μL底物，18-25℃孵育10分钟，加入100μL终止液，混匀，10分钟内在450nm波长的酶标仪上读数。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 22.0 软件进行统计学回归分析及ROC分析。

2 结 果

2.1 感染相关指标结果比较

本研究评估了45例有AKI的脓毒症患者(29例AKIⅠ期患者、7例AKIⅡ期患者和9例AKI Ⅲ期患者)和45例无AKI的脓毒症患者的肝素结合蛋白水平。有AKI的脓毒症患者血浆中的肝素结合蛋白水平明显高于无AKI的脓毒症患者，而且AKI分期越高，肝素结合蛋白的含量越多。多元回归分析显示，HBP（峰值和平均水平）与性别、年龄、血清C反应蛋白、白细胞计数之间没有关联。研究结果表明，峰值HBP和平均HBP都可以用来区分AKI和非AKI，峰值HBP显示出更高的区分水平。具体结果见表1。

表1 HBP与AKI及性别、年龄、血清C反应蛋白、白细胞计数关系表

2.2 血浆肝素结合蛋白ROC分析

对血浆肝素结合蛋白诊断脓毒症AKI患者的敏感性和特异性进行了ROC分析，以评估血浆HBP是否为诊断和鉴别AKI分期的有效指标。最佳峰值HBP截止值为23.89 ng/mL(95%CI[7.07-40.72])，用于区分AKI与非AKI，其灵敏度和特异性为0.79和0.56，AUC为0.67(95%CI[0.46-0.87]。对于平均HBP，AKI与非AKI的最佳截止值为20.46 ng/mL(95%CI[8.53-32.39])，试验的敏感性和特异性分别为0.73和0.56，AUC为0.61(95%CI[0.40-0.81])。上述见图1

图 1 HBP 对有AKI和无AKI患者的ROC分析图

3 讨 论

在本研究中，我们评估中性粒细胞衍生的HBP是否为脓毒症急性肾损伤的指标。在伴有AKI的脓毒症患者中，HBP显著升高，并与急性肾功能衰竭的严重程度进一步相关，HBP水平在AKI Ⅲ 期最高。值得一提的是，在我们的研究中，9例AKI Ⅲ 期患者中有8例需要肾脏替代治疗(RRT)。有研究表明，虽然肾损害可能导致HBP的肾清除率高于健康个体，但通过持续的RRT，HBP水平没有显著降低[6]。本实验证实了他的结论，接受RRT的AKI Ⅲ 期患者的HBP水平最高。肝素结合蛋白作为血液循环中中性粒细胞衍生物质的重要指标，以前曾在动物模型中对AKI进行过研究，并被证明与脓毒症中影响肾单位的病理有关。虽然在一些实验中，没有蛋白酶活性被归因于这种分子，但它是中性粒细胞活化和脱颗粒的理想指标。当检测到HBP水平升高时，其他蛋白酶也会释放到血液循环中。对中性粒细胞衍生细胞产物的病理机制和细胞破坏过程的启动进行了大量的研究。一方面，中性粒细胞胞外陷阱(NET)已被证明通过激活凝血过程和内皮损伤触发级联，导致血栓性微血管病变。另一方面，各种蛋白酶敏感受体在内皮细胞表面表达，在切割时可导致内皮细胞活化。内皮细胞的激活需要增加血管床的通透性和液体外渗。 这对肾单位的微环境特别重要，特别是在近端小管上微调平衡的干扰导致流体、电解质和底物再吸收的损害。 近端肾小管细胞的不平衡可能导致细胞极性丧失、刷缘丧失和与AKI相关的铸型形成等病理。对于临床实践，这表明早期干预，在脓毒症导致中性粒细胞过度脱颗粒之前，可能对防止细胞损伤具有重要意义。作为中性粒细胞来源的指示蛋白，在脓毒症AKI患者中检测到HBP水平显著升高。以往的研究表明，HBP在脓毒症、心脏和呼吸衰竭以及各种感染过程中参与血管渗漏、趋化和炎症的分子病理机制[7]。 它不仅被认为是一个有前途的诊断指标，而且与疾病的严重程度具有预后相关性[8]。我们研究的主要局限性是回顾性，由于预先定义的研究条件，从而限制了分析的数量，此外，没有用尿液标本验证本实验，一方面是因为很多患者出现无尿，另一方面是因为用于HBP分析的检测在技术上不被批准用于尿液样本。本研究的目的不是确定HBP在脓毒症期间AKI发病机制中的作用，而是探讨它在脓毒症AKI患者诊断中的意义。本实验提供了HBP截断值来检测脓毒症AKI患者，并证明HBP是一种新型、快速、有效的脓毒症AKI患者诊断的生物标志物。本研究不仅探讨了肝素结合蛋白对于脓毒症AKI及其分期诊断的意义，而且为今后研究脓毒症AKI的发病机制和治疗方法提供了依据。