调心通督针刺法对血管性痴呆大鼠海马内Ang-1表达影响的实验研究

朱钰 廖家鑫 王润鹏 谭涛

【摘要】 目的：觀察调心通督针刺法对血管性痴呆（VD）模型大鼠海马组织内Ang-1表达水平的影响，探讨调心通督针刺法对治疗VD模型大鼠可能的机制。方法：将24只SD大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、药物对照组、调心通督组，每组6只。对除假手术组外的其他三组大鼠采用2-VO法进行VD模型制备。造模成功2周后，药物对照组行尼莫地平灌胃干预治疗、调心通督组行调心通督针刺法干预治疗。采用Morris水迷宫试验测试大鼠认知及学习能力;采用Western-blot法对各组大鼠脑海马组织中Ang-1表达水平进行检测。结果：与模型组比较，药物对照组和调心通督组的逃避潜伏期均缩短、跨越次数均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）;药物对照组和调心通督组Ang-1/β-actin值均高于模型组（P<0.05）;但药物对照组和调心通督组逃避潜伏期、跨越次数、Ang-1/β-actin值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：调心通督针刺法在一定程度上能改善VD大鼠学习行为能力，其作用机制可能与促进大鼠海马组织中Ang-1表达相关。

【关键词】 调心通督针刺法 血管性痴呆 血管新生 血管生成素-1

Experiment Study on the Effect of Tiaoxin Tongdu Acupuncture on Ang-1 Expression in Hippocampus of Vascular Dementia Rats/ZHU Yu， LIAO Jiaxin， WANG Runpeng， TAN Tao. //Medical Innovation of China， 2020， 17（03）： 0-024

[Abstract] Objective： To observe the effect of Tiaoxin Tongdu acupuncture on the expression of Ang-1

in the hippocampus of vascular dementia （VD） rats， and to explore the possible mechanism of Tiaoxin Tongdu acupuncture on VD rats. Method： Twenty four SD rats were randomly divided into four groups： sham operation group， model group， drug control group， Tiaoxin Tongdu group， 6 rats in each group. In addition to the sham operation group， the other three groups of rats were used 2-VO method to prepare VD model. Two weeks after the successful establishment of the model， the drug control group was given Nimodipine by gavage， Tiaoxin Tongdu group was given Tiaoxin Tongdu acupuncture. Morris water maze test was used to test the cognitive and learning ability of rats， and Western-blot method was used to detect the expression level of Ang-1 in the hippocampus of rats in each group. Result： Compared with the model group， the escape latency were shortened and stride across times were increased in the drug control group and the Tiaoxin Tongdu group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The value of Ang-1/β-actin in drug control group and Tiaoxin Tongdu group were higher than those in model group （P<0.05）. However， the escape latency， stride across times and Ang-1/β-actin values of the drug control group and Tiaoxin Tongdu group were compared， the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： To some extent， Tiaoxin Tongdu acupuncture can improve the learning behavior of VD rats， and its mechanism may be related to the promotion of Ang-1 expression in the hippocampus of rats.

[Key words] Tiaoxin Tongdu acupuncture Vascular dementia Angiogenesis Angiopoietin-1

First-authors address： Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.03.006

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指因脑血管类疾病引起脑功能的障碍，从而产生一系列智能损害的综合征，临床表现多为持续性和获得性的高级认知功能损伤[1]。近年来，随着人口老龄化的加剧，我国的VD患病率为0.12%～0.35%，年病死率为10.27%～25.7%，且患病后死亡风险会增加0.63～2.59倍[2]。目前临床上对VD尚无明确的诊断和治疗标准[3]，常用的治疗方法包括增加脑细胞代谢、促进脑血液循环、减轻脑组织炎症反应等对症治疗[4]，暂无特效的治疗方法。调心通督针刺法以手厥阴心包经诸穴配合督脉穴位振发体内阳气、温煦脏腑脑髓，以达到调理脏腑、通络开窍、标本兼治的目的。本课题组在前期临床实验中证实调心通督针刺法可有效提高VD患者MMSE智力评分，显著改善患者临床症状[5]，但其机制尚不明确。促血管生成素（angiopoietin，Ang）是继血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）之后，近年来发现的第二类血管生成因子家族，它由血管平滑肌细胞、成纤维细胞、周细胞等血管内皮细胞周围的支持细胞所分泌[6]。研究发现，Ang-1与其受体结合后，可促进缺血区新生血管数量的增加和侧支循环的建立，并且减少了神经元细胞的凋亡，从而有利于神经元传导及传递信息功能的恢复[7-8]。本实验通过观察调心通督针刺法对VD模型大鼠海马中Ang-1表达水平的影响，来探讨调心通督针刺法的作用机制，为临床治疗提供动物实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组 健康SPF级SD雄性大鼠24只，体质量（230±20）g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK（湘）2016-0002。实验动物饲养及观察在湖南中医药大学实验中心进行（SPF级），控制温度20～25 ℃，湿度50%～60%，分笼饲养，自由饮水、标准颗粒饲料喂养。适应性喂养1周后，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、药物对照组、调心通督组，每组6只。

1.2 试剂和仪器 10%水合氯醛（长沙维尔生物科技有限公司）、尼莫地平片（生产厂家：郑州瑞康制药有限公司，批准文号：国药准字H41022175）、氨苄西林胶囊（生产厂家：哈药集团制药总厂，批准文号：国药准字H23022658）、Anti-VEGF（19003-1-AP，美国proteintech公司）、Anti-ST2（23302-1-AP，美国proteintech公司）、β-actin antibody（60008-1-Ig，美国proteintech公司）、HRP goat anti-mouse IgG（SA00001-1，美国proteintech公司）、HRP goat anti-rabbit IgG（SA00001-2，美国proteintech公司）、安迪牌一次性针灸针0.25 mm×25 mm（贵州安迪医疗设备有限公司）、Mirros水迷宫（湖南中医药大学第一附属医院实验中心提供）、眼科手术剪（长沙维尔生物科技有限公司）、眼科用手术镊（长沙维尔生物科技有限公司）。

1.3 模型制备与评价 采用两血管阻断法（2-VO）制备VD模型[9]：将大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，后仰卧位固定在手术台上，颈部剪毛备皮，碘伏消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉（CCA），用4号缝合线结扎双侧颈总动脉远心端与近心端，从中剪断血管，术后在创口处撒适量青霉素粉末，缝合伤口，放回笼中保温饲养。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不进行结扎及剪断。模型评价：造模2周后，分别对每只大鼠进行Morris水迷宫测试，以造模前假手术组大鼠逃避潜伏期均值作为参考标准，计算造模后每只大鼠逃避潜伏期均值和参考值之差与参考值的比值，>20%即为大鼠VD模型[10]。

1.4 干预措施 （1）调心通督组：VD模型复制成功后，参照华兴邦动物穴位图谱及《实验针灸学》[11-12]，取“百会”“神庭”“大椎”“水沟”“风府”“命门”行斜刺，“内关”“大陵”“劳宫”行直刺，捆绑后针刺，穿透大鼠皮肤1～2 mm，进针后行小幅度捻转，予平补平泻手法，每10分钟行针1次，共留针30 min，1次/d，连续治疗2周。（2）药物对照组：该组大鼠给予尼莫地平0.062 5 g/kg与蒸馏水混合后制成混悬液，按10 mL/kg体重灌胃，灌胃后与调心通督组同时捆绑，1次/d，连续2周。（3）模型组与假手术组同调心通督组捆绑，不针刺，不给药，疗程同调心通督组。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 Morris水迷宫行为学检测 治疗结束后再次进行Morris水迷宫检测。在圆形水池内加入清水，水池直径160 cm，高40 cm，水深30 cm。将池壁上4个等距离点分水池为4个象限，任选一象限正中放置无色透明圆形平台，使平台没入水下2 cm。检测包括定位航行实验和空间探索实验。（1）定位航行实验：第1天为适应性训练，第2天开始连续测试4 d，每天4次，每次将大鼠分别从不同的4个象限放入水中，记录其120 s内寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期。如果120 s之内未找到平台，则由实验员帮助引导其上平台，并停留10 s，记录逃避潜伏期为120 s。（2）空间探索实验：第4天测试结束后，撤除平台，于平台所在位置对侧象限将大鼠放入水中，记录120 s内大鼠游过原平台所在位置的次数。

1.5.2 海马Ang-1测定 将大鼠用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉后断头取脑，置于冰盘上，迅速分离出海马组织，按照重量和体积1︰10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆，12 000 r/min离心10 min后，收集上清液，采用Western-blot测定，操作遵照试剂盒说明进行。

1.6 统计学处理 使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Mirrors水迷宫检测结果比较 与假手术组比较，模型组逃避潜伏期延长、跨越次数减少，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，药物对照组和调心通督组的逃避潜伏期均缩短、跨越次数均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）;但药物对照组和调心通督组逃避潜伏期、跨越次数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠海马Ang-1表达水平比较 Western-blot检测结果显示，假手术组、模型组、药物对照组、调心通督组Ang-1/β-actin值分别为（0.290±0.057）、（0.365±0.031）、（0.617±0.044）、（0.560±0.053）。模型组、药物对照组、调心通督组Ang-1/β-actin值均高于假手术组（P<0.05）;药物对照组和调心通督组Ang-1/β-actin值均高于模型组（P<0.05），但药物对照组和调心通督组Ang-1/β-actin值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

3 讨论

祖国医学中，痴呆根据其临床症状归属于“癫证”“呆痴”“善忘”的范畴，其病位在脑，病机一般为脑髓消减、痰瘀痹阻、神机失用。调心通督针刺法是全国名老中医严洁教授总结多年临床经验，结合科研实践所创立的一种针刺方法。调心通督针刺法认为脑主神明是脑生理功能的基本部分，是思虑、记忆、司主肢窍的重要前提，而心为“君主之官”“五脏六腑之大主”，充分说明了心和神明的密切联系，故神志类疾病均可从心论治。然而心包作为心的屏障，可代心受邪，故本法选取手厥阴心包经作为治疗途径之一。脑窍和神志的清明与督脉功能密切相关，故有“病变在脑，首取督脉”之说[13]，督脉总督人体一身之阳，其循行“上额交巅，入络脑”，且督脉源于胞中，与脑、髓、肾精关系密切，精生髓，髓充脑，脑宁则神安。故将心包经与督脉相配，共奏调理脏腑、安神定志之效。

VD患者临床主要表现为学习记忆能力的减退，此类表现的主要脑功能区在海马。海马区是人类学习记忆的关键部位，同时也是对脑缺血的敏感区域[14]，短暂性脑缺血即可造成海马区神经元不可逆性结构损伤。所以，在脑缺血后建立侧支循环以增加缺血区血流量，改善缺血区周围的血氧含量，从而减轻缺血损伤是十分重要的。血管新生是由多种促血管生成因子和抑制血管生成因子相互作用的结果。Ang是一族特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，也是最重要的血管稳定因子，其对脑缺血后的血管新生有正性调控的作用[15]。Ang-1具有诱导内皮细胞迁移和增殖的能力，并且能够特异性的激活受体Tie2，使其在血管内皮细胞中表达，以此促进血管的新生[16-17]。研究发现，Ang-1具有促进血管生成、稳定血管的作用，在脑缺血后，可通过多重作用机制，改善脑血流灌注，挽救缺血半暗带的神经元，以此改善脑缺血后神经功能的预后[18-19]。除此之外，Ang-1还具有减轻血管炎症反应、减少血管内皮细胞凋亡等作用[20-21]。

本实验通过观察各组大鼠海马组织中Ang-1的表达变化以及行为学检测发现，与模型组比较，药物对照组和调心通督组的逃避潜伏期均缩短、跨越次数均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，药物对照组和调心通督组Ang-1表达水平均上调（P<0.05）;但药物对照组和调心通督组逃避潜伏期、跨越次数、Ang-1/β-actin值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。由于大鼠的脑组织损伤会促进机体的自我调节，从而产生Ang-1的表达释放，故模型组中Ang-1高于假手术，针刺治疗及药物治疗均可促进Ang-1的表达，故干预方法有效。且上述结果说明药物及调心通督针刺法均能改善VD大鼠的学习记忆能力，且均可通过上调Ang-1水平改善VD大鼠的学习记忆能力，这与笔者在临床的研究发现一致。

综上所述，结合本实验结果，提示采用调心通督针刺法控制甚至逆转VD患者认知功能障碍是可行的，进一步揭示调心通督针刺法治疗VD的机制可能与调控脑海马组织中Ang-1蛋白的表达，从而促进脑缺血区血管新生有关，由此为临床应用和推广调心通督针刺法治疗VD提供了可靠的动物实验依据。

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（收稿日期：2019-11-15） （本文编辑：董悦）