不同时间电针头穴预处理对MCAO大鼠脑皮质MicroRNA-210表达的影响❋

梁 超，鲍春龄，姜 涛，张燕珍，陈邦国

(1. 海口市中医医院，海南 海口 570216； 2. 湖北中医药大学针灸骨伤学院,武汉 430000)

缺血性脑血管病是一种致残率极高的疾病，据估计该病3/4的患者有不同程度的劳动能力丧失，其中重度残疾约占40%[1]。上个世纪90年代就有研究证明，缺血预处理能增加人体组织缺血、缺氧耐受以减轻缺血疾病后组织的损伤。近年来，从该病的流行病学角度来看，该病的积极预防意义远大于该病的治疗[2]，因此越来越多的研究关注于针灸预防缺血性脑血管疾病的发生发展[3-4]。MicroRNA-210是一种重要的内源性非编码小RNA，也是缺氧特应性的MicroRNA[5]，它参与缺血缺氧后血管形成的过程，但是其表达对脑缺血血管新生的影响作用尚不清楚。因此本研究以电针为立足点，观察不同时间电针预处理对局灶性脑缺血大鼠局部脑皮质中MicroRNA-210表达变化及微血管内皮细胞的影响，初步探讨电针预防急性脑血管病的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年SD大鼠60只(湖北省实验动物研究中心提供，许可证号SCXK(鄂)2015-0018)，雌雄不拘，体质量(200±20) g。于实验前1周一次性购进，饲养于安静、温暖且避强光的环境中，室温(20±2 ℃)，自由饮水饮食。

1.2 主要试剂与仪器

Ki-67抗体(abcam)、浓缩型正常山羊血清(封闭)、荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(均购自武汉博士德生物工程有限公司)、抗荧光淬灭封片剂(碧云天生物科技有限公司)等。病理切片机(德国Leica RM 2016轮转式切片机)、荧光显微镜(NIKON Eclipse 80i生物显微镜)、实时荧光定量PCR仪(ABI7900 / illumina eco)、分光光度计(上海舜宇恒科学仪器有限公司)、PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理 60只SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、模型组、安慰针刺组、电针预处理5 d组、电针预处理10 d组、电针预处理15 d组，每组大鼠各10只。正常对照组大鼠不予处理，正常给水给食；模型组大鼠按要求制备MCAO模型；安慰针刺组大鼠安慰针刺15 d后制备MCAO模型；电针预处理各组分别针刺治疗5 d、10 d、15 d后制备MCAO模型。

1.3.2 动物模型制备 参照Longa[6]线栓法加以改进，制备MCAO模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，称重并以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉；仰卧固定于手术台，常规备皮消毒，颈部正中切口，钝性分离皮下筋膜和肌肉，暴露并分离出右侧颈总动脉(common carotid arternal,CCA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)。电凝ECA的分支，结扎游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉(pterygo palatine artery,PPA)，并在其起始部和CCA的近心端各置一动脉夹。将ECA残端轻拉向下剪0.2 mm小口，轻推尼龙线尾端经CCA分叉部沿ICA入颅，至大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)，在线栓经MCA和PPA分叉处时用玻璃分针调整方向，以便线栓顺利进入MCA。尼龙线插入深度由CCA分叉部计约18 mm。栓塞60 min拉出尼龙线，使血流再灌。缝合切口，消毒。手术后大鼠室温下禁食给水喂养，苏醒后进行神经功能障碍评分以判断是否造模成功。只有神经功能障碍在1级以上的大鼠才能保留下来。

1.3.3 治疗方法 电针预处理组大鼠取健侧百会透曲鬓、百会透悬厘进行治疗。取穴标准及针刺深度参照中国针灸学会实验针灸研究会华兴邦[7]等制定的《常用动物腧穴图谱》标准及《头皮针穴名国际标准化方案》[8]。百会为顶骨正中点，曲鬓为耳缘直上与耳尖水平线的交点，悬厘为头维穴与曲鬓穴弧形连线的上3/4与下1/4交点处；选用30号1寸一次性无菌针灸针，分别从顶骨中点向耳根前与头皮呈15°夹角透刺0.5～0.8寸，在2组穴位的连线上接力式刺3针，快速捻转200 r/min以上，捻转2 min后接LH202H型韩氏仪，采用疏密波频率2 Hz/100 Hz，强度1 mA，每次持续刺激30 min。安慰针刺组采用套迭式顿头安慰针，底座固定于穴位处，左手固定针管，右手快速叩击顿头安慰针，局部皮肤针刺感但不刺入皮肤，不予加电刺激；安慰针刺组连续治疗15 d后造模；电针预处理5 d组、10 d组和15 d组分别用以上电针方法连续治疗5 d、10 d、15 d后分别造模，大鼠均在造模成功后24 h内进行评分、取材。

2 观察指标及方法

2.1 神经功能缺损评分(NSS)

各组大鼠分别在造模清醒后参照Longa的5级神经功能评分标准进行评估。1级: 左前肢不能充分伸展，计1分；2级: 向左环形运动，轻度局灶神经功能缺失，计2分；3级:向左侧倒，中度局灶神经功能缺失，计3分；4级:不能自然行走，重度局灶神经功能缺失，计4分。

2.2 血管内皮细胞增殖数目

采用免疫荧光法检测中微血管内皮细胞增殖数目。大鼠灌注后迅速取脑，所取组织脱水、包埋、切片，然后进行切片脱蜡和抗原修复10～15 min，用PBS(pH7.4)冲洗切片3遍，每次3 min；滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30 min，然后滴加稀释好的一抗(1∶200)，加完一抗后于4 ℃湿盒中孵育过夜；PBST冲洗切片3次，每次3 min，滴加稀释好的荧光二抗，20～37 ℃孵育1 h，PBST冲洗切片4次，每次3 min；在暗处滴加DAPI避光孵育5 min进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。结果判定，ki67免疫荧光染色以细胞核出现红色或橙红色颗粒为阳性细胞；在高倍(×400)光学显微镜下随机选取5个视野，计算缺血皮质中ki67标记的阳性细胞数，并计数平均值为血管内皮增殖细胞数目。

2.3 实时荧光定量PCR检测MicroRNA-210表达

造模24 h后用10%水合氯醛麻醉大鼠，断头取脑保存于-80 ℃冰箱。按照TRizol说明书中的方法提取脑缺血组织中总RNA。在20 μL反转录反应体系中，以1 μL RNA为模板将mRNA反转录为cDNA。PCR反应以U6为内参，U6上游引物序列：5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC -3′，下游引物序列：5′- AAATATGGAACGCTTCACGA -3′；MicroRNA-210引物序列：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC GACTCAGCCGC-3′；反应体系为20 μL，扩增结束后，PCR产物的定量校正和判定分析采用U6作为内参照，用U6的拷贝数作为校正基数，通过各样本中MicroRNA-210的CT(cycle threshold)值，分别与对应样本中U6的CT值相减，即获得MicroRNA-210的△CT值；分别以模型组的△CT值作为校正得出-△△CT值，2-△△Ct公式计算出各样本中MicroRNA-210的表达。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 神经功能损伤评分(NSS)结果

缺血后各组大鼠神经功能损伤评分均升高，模型组与安慰针刺组比较差异无统计学意义(P>0.05)，电针预处理后NSS分值低于模型组和安慰针刺组，电针预处理15 d组分值最低(P<0.01)。

3.2 血管内皮细胞数目比较结果

安慰针刺组微血管内皮细胞数与模型组的区别不大(P>0.05)，各预处理组比安慰针刺组的细胞数目均多(P<0.05)，且电针预处理15 d组细胞增殖数目最多(P<0.01)。

3.3 MicroRNA-210表达比较

安慰针刺组MicroRNA-210表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；预处理后MicroRNA-210相对表达较安慰针刺组明显减少(P<0.05)；电针预处理5 d组较其他2组的表达量多(P<0.01)，电针预处理10 d组与预处理15 d组间表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

脑卒中发生后气机逆乱，导致窍闭神匿，神不导气，留滞陈瘀。若气血盛则经脉通，正气得以扶助，瘀血得以祛除，血络得以新生，脑髓气化向愈，机体功能逐渐恢复。头穴治疗中风病早就被肯定和记载。《针灸大成·玉龙歌》中说：“中风不语最难医，发际顶门穴要知，更向百会明补泻，即时苏醒免灾难。”在《针灸大成·卷八·中风瘫痪针灸秘诀》中亦明确指出：“百会、耳前发际”为治疗中风风邪入腑以致手足不遂的要穴。《普济方》记载：“凡忽中风言语骞涩，半身不遂……穴百会，耳前发际(曲鬓穴)……神效。” 头为诸阳之会，气血聚集之要，“病变在脑、首选督脉”为历代医家的共识[9]。于志顺也提出，中风后出现的肢体偏瘫及功能障碍，选用从百会、前至神庭、两侧至曲鬓的菱形区内效果较好[10]。本研究选用百会穴调节全身各经脉之经气，通畅气血，充盛脑髓，上荣于脑；曲鬓为足少阳、太阳之会，悬厘为手足少阳、阳明之会，三穴同刺可直接鼓动经气畅行，激发脏腑之气疏通闭阻，达到“旺盛气血、去瘀生新”的作用。课题组前期研究发现，“百会透曲鬓、悬厘”两穴不仅能改善脑电活动，缩小梗死体积，减轻炎症反应，抑制神经元凋亡，还在促进血管新生方面效果显著[11-12]。进一步得出该穴位的透刺还能影响脑缺血后MicroRNA-210的表达，通过抑制作用减轻神经功能损伤。

表1 各组大鼠NSS、增殖内皮细胞数和 MicroRNA-210表达比较

注：NSS评分中，与正常对照组比较：*P<0.05；与安慰针刺组比较：△P<0.05；微血管内皮细胞数目与模型组比较：*P<0.05；与安慰针刺组比较：△P<0.01；MicroRNA-210表达与正常对照组比较：*P<0.05；与安慰针刺组比较：△P<0.05

预处理可以归结于中医“治未病”范畴，体现了“预防为主”的医学思想，其潜在的机制可能涉及调节神经递质、炎症因子、腺苷等相关分子生物网络信号通路传导，以干预细胞周期中DNA自我修复/重塑机制等[13-14]。在脑缺血之前给予针刺刺激，诱导脑组织细胞对抗脑缺血缺氧而产生耐受，从而产生部分脑保护作用的处理措施，称为针刺预处理[15]。对于急性脑梗塞而言，针刺预处理后可以不同程度地激活某些中介因子和信号通路的开放，促进血管新生，以增强机体对缺血缺氧的耐受效应，以减轻神经功能损伤[16-17]。如增加脑缺血大鼠骨髓和外周血中EPCs含量[18]，促进血脑屏障MMP-9阳性表达及VEGF mRNA的表达，以增强血管新生效应[19]。其具体机制目前没有完全阐明，但MicroRNAs与其相关性研究逐渐成为热点。

MicroRNAs(miRNAs)是近年来发现的一种重要的内源性非编码小RNA(20～25个碱基)，在进化上高度保守，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢及个体发育等生物学过程。其在缺血性脑血管疾病的发生发展过程中发挥着重要作用，与炎症反应、神经元凋亡及血管新生均有关系[20]。 MicroRNA-210在急性脑缺血后水平显著上调，在第3天和第7天达到高峰，这与体内缺血缺氧环境有关[21]。其高表达不光是在急性脑缺血的早期，而是在病理变化未发生时已启动，从而在缺血超早期参与神经修复过程[22]。针刺对脑缺血后miRNAs的表达也具有调控作用，可以提高MiRNA-290、MiRNA-494表达，并降低AQP-4相对含量以减轻脑损伤[23]。本实验造模后MicroRNA-210水平显著上调，不同的是经过电针头穴预处理后该基因的含量有所降低，特别是经过15 d治疗后，MCAO大鼠的MicroRNA-210与正常组比较差异无统计学意义，说明电针预处理能明显降低急性脑缺血后脑皮质中MicroRNA-210基因的表达。

局灶性脑缺血最主要的原因来自动脉粥样硬化后栓子脱落所造成的脑动脉闭塞[24]，因此及时恢复或改善大脑的血液供应是中风后功能恢复的关键，而脑缺血后血流的恢复又依赖于局部血管的代偿与新生[25]。无论是局部脑皮质微血管还是血脑屏障，血管的新生首先出现变化的都是内皮细胞。MicroRNA-210可以调控血管内皮细胞的存活、增殖、凋亡及细胞间的连接[26-27]。本研究发现，电针预处理能有效促进内皮细胞增殖，从结果可看出在预处理15 d组的增殖血管内皮细胞最多，此时的MicroRNA-210的表达最少，说明电针治疗降低缺血后MicroRNA-210的表达，内皮细胞的增殖可能与此有关。因为在缺血后血管新生过程中，MicroRNAs具有2种不同的作用[28]，一种促血管生成，一种抗血管生成，在此研究中MicroRNA-210就属于第一种。

综上，电针头穴预处理可使MACO大鼠的神经功能损伤得到改善，说明电针头穴预处理提高了大鼠缺血缺氧耐受程度，抑制局部脑皮质中MicroRNA-210的基因表达以干预血管内皮细胞增殖，促进缺血后局部血液循环。这一作用可能是电针头穴预防脑血管疾病的机制之一。