肾精亏虚对雄性大鼠骨质的影响*

李少华 朱 娟 康 硕 段豫磊 史建红 高文山△ 董晓东#

（河北大学，1 附属医院新生儿科，2 医学院，保定 071000）

截至到2015年，我国60 周岁以上人口约占总人口的17.9%[1]，而骨质疏松症（osteoporosis）是与衰老密切相关的骨骼疾病[2]。目前，常见的雄性骨质疏松模型动物为激素诱发的去势（去睾丸）骨质疏松模型大鼠，但存在机体损伤大、并发症多等缺点[3]。中医理论认为，房劳是“肾精亏虚”的重要诱因，而“肾精亏虚”是促进衰老并伴随骨质疏松症的主要发病机制。本研究依据传统医学“肾主骨生髓”理论，采用“房劳”的方法建立“肾精亏虚”模型动物，探讨“肾精亏虚”对骨质的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

30 只SPF 级Wistar 雄性大鼠（250～300 g；河北医科大学动物实验中心购买，动物伦理许可证号：IACUC-2018018），适应性喂养1 周，控制温度22.0℃±0.2℃，自由进食。

1.2 主要试剂

苏木精-伊红染液、戊巴比妥钠溶液（50 mg/kg）（索莱宝公司）；多聚甲醛、乙二胺四乙酸（科密欧公司）；p16抗体（1∶100，Abcam公司）；1型前胶原氨基端延长肽（N.terminal propeptide of type I collagen，P1NP）与1型胶原C末端肽（cross linked C-telopeptide of type I collagen，CTX-1）检测试剂盒（睿信生物科技公司）。

1.3 “肾精亏虚”模型雄性大鼠的建立

Wistar 雄性大鼠（250～300 g）适应性饲养1周后，用计算机随机数法分为正常组、模型组以及自然衰老组，每组10 只。其中模型组采用“房劳”的复合伤肾法复制“肾精亏虚”模型动物。

采用电针疗仪（华佗牌，SDZ-Ⅱ）自制成电刺激仪，用电针刺激雄性大鼠的大腿内侧性相对敏感区（选用连续波输出模式，输出脉冲频率 40 Hz，输出电流2 mA）刺激生殖股神经的股区[4]，引起大腿内侧部皮肤神经兴奋，使精囊、提睾肌收缩，使其阴茎逐渐勃起并射精，达到人工耗伤生殖之精的目的。由于大鼠一般是在夜间进行交配，所以刺激时间选择在晚上20：00，持续7 d，间隔3 d，3 个循环，共30 d。

1.4 ELISA 检测血清中P1NP 和CTX-1 水平

按 ELISA 试剂盒说明书操作流程检测血清中P1NP 和CTX-1 水平。

1.5 骨密度测量

取材前1 周将各组大鼠用戊巴比妥钠溶液麻醉后，采用Prodigy Advance 型双能X 射线骨密度分析仪系统对大鼠的全身进行骨密度测定。

1.6 取材

正常组及模型组于12月龄时取材，自然衰老对照组大鼠于16月龄时取材。按照大鼠与人类寿命换算，12月龄与16月龄大鼠相当于人类40 岁中年期以及60 岁老年期[5]。各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液，待大鼠进入麻醉状态后，内眦取血，离心分离血清；并取出双侧胫骨，分离肌肉筋膜，立即投入4%多聚甲醛固定液中，4℃固定48 h。

1.7 骨组织石蜡切片制备

按照文献制备骨组织石蜡切片[6]。胫骨从4%多聚甲醛固定液中取出，PBS 缓冲液冲洗3 次，置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）（pH7.0，4℃）中脱钙14 d，用大头针可无阻力刺穿骨组织时即为脱钙成功，取干骺端进行石蜡包埋。半自动切片机（RM2135，Leica）进行4 μm 厚的骨纵向 切片。

1.8 H-E 染色和p16 蛋白免疫荧光化学染色

对骨切片脱蜡水化后，进行H-E 染色，在光学显微镜下观察骨组织的形态结构；免疫荧光化学染色后，荧光显微镜下观察p16 蛋白表达情况，并利用Image J 软件进行分析。

1.9 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析。满足正态分布的计量资料以±s表示，均数比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齐，两两比较采用最小显著差异（least significant difference，LSD）t检验；若方差不齐，则采用Dunnett-t检验，进行两两比较。

2 结果

2.1 造模后大鼠的变化情况

造模后，模型组大鼠出现毛色暗淡无光泽，精神萎糜不振，体质量稍有减轻并增长缓慢，反应迟钝等明显的“肾精亏虚”表现。

2.2 血清P1NP 与CTX-1 水平比较

ELISA 检测结果显示，与正常组（0.503± 0.004）比较，模型组（0.557±0.002）和自然衰老组（0.537±0.012）大鼠血清CTX-1 含量显著升高（P＜0.05），模型组（0.557±0.002）与自然衰老组（0.537±0.012）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；正常组血清P1NP 水平为0.430±0.032，模型组为0.461±0.012，自然衰老组为0.458±0.042，3 组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 骨密度比较

与正常组（11.23±2.23）比较，模型组（8.94±1.78）与自然衰老组（10.04±1.84）大鼠全身BMD 显著降低（P＜0.05），模型组与自然衰老组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

2.4 骨小梁分布比较

H-E 染色显示，正常组大鼠胫骨干骺端骨小梁分布均匀，排列密集，呈网状结构，骨小梁粗细、间距有序。模型组和自然衰老组大鼠骨小梁明显稀疏，间距增宽，粗细不均且出现断裂（图2）。

2.5 p16 蛋白表达比较

免疫荧光化学染色显示，p16 蛋白定位于细胞核呈红色荧光，核DAPI 呈蓝色。模型组（82.97±1.95）和自然衰老组（85.56±2.07）大鼠骨组织中p16 蛋白阳性细胞数百分比明显高于正常组（21.19±2.48），差异有统计学意义（P＜0.05），模型组与自然衰老组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

图1 各组骨密度比较。A：正常组；B：模型组；C：自然衰老组.Fig1 Comparison of bone mineral density in each group.A：Normal group; B：Model group; C：Aging group.

图2 各组骨小梁分布比较，×400。A：正常组；B：模型组；C：自然衰老组.Fig2 Comparison of bone trabeculae distribution in each group，× 400.A：Normal group; B：Model group; C：Aging group.

图3 各组p16 蛋白表达比较，×400。A1～A3：正常组; B1～B3：模型组; C1～C3：自然衰老组；1：p16 蛋白表达；2：DAPI 复染；3：合并.Fig3 Comparison of p16 protein expression in each group，×400.A1-A3：Normal group; B1-B3：Model group; C1-C3：Aging group；1：p16 protein expression；2：DAPI；3：Merge.

3 讨论

依据“肾藏精”中医理论：肾为先天之本，“肾主骨生髓，肾主生殖”立论[7]，故“肾精亏虚”可影响骨骼发育和生殖功能[8]，而肾精盛衰与年龄有关，肾精在青壮年阶段较为充盛，而后随着年龄的增长，肾精逐渐耗竭，终致衰老。因此，肾精亏虚证常见于中老年阶段[9]。中医理论认为：节欲养生者，年虽老而能积精全神；纵欲耗真者，年虽少而精薄神虚[10]。房事由肾所主，房劳太过可伤肾之阴、阳，房劳所伤当以伐伤肾精为主，此即《素问上古天真论》“以欲竭其精”之意，故本实验采用房劳方法建立“肾精亏虚”模型动物。有研究表明，采用房劳方法建立此模型后，雄鼠子代生育力损伤[18]，精子密度和活动力下降，并且表现出与此研究中出现类似的肾精亏虚表现。比起传统的自然衰老模型，这种造模方法节约饲养经济成本，操作简单，时间周期较短，此模型易于复制。

现代医学中p16 是衰老标志物之一[11-13]。本研究结果可见模型组和自然衰老组大鼠骨组织中p16阳性细胞数明显高于正常组，提示肾精亏虚可促进大鼠骨组织衰老。

骨骼在整个生命过程中通过骨吸收和骨形成的动态平衡状态，使骨骼不断重塑[14]，当两者的动态平衡被破坏将造成骨质疏松。人的骨量在30 岁时达到峰值，而后骨质量逐渐降低[15]。随着年龄的增加，骨吸收超过骨形成，骨吸收逐渐增多，骨形成速度减缓。P1NP 是骨形成标记物，CTX-1 是骨吸收标记物[16]。已知老年性骨质疏松症是Ⅱ型原发性骨质疏松症，主要特征是骨密度下降、骨小梁间隙变大、血清CTX-1 含量增多以及P1NP 含量不会出现明显变化[17]。本研究结果同时可见，与正常组比较，模型组和自然衰老组大鼠骨密度明显降低，骨小梁粗细不均、稀疏而断裂，提示“肾精亏虚”与骨质疏松密切相关。综上所述，“肾精亏虚”可促进雄性大鼠骨质疏松。