穿根藤抗炎成分车叶草苷的提取工艺研究

洪影雯　梁子宁　廖桂秀　韦丽翠　龙琪云

摘要：采用高效液相色谱法建立穿根藤（Psychotria serpens L.）车叶草苷含量测定的方法，以车叶草苷含量为指标，在甲醇溶液质量分数、料液比、提取时间单因素试验的基础上，结合正交试验优化提取工艺。结果表明，车叶草苷的最佳提取工艺为70%甲醇溶液、料液比1∶60，提取时间30 min。

关键词：穿根藤（Psychotria serpens L.）;车叶草苷;提取工艺

中图分类号：TQ461         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）02-0141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.031           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Extraction technology of anti-inflammatory constituent

asperuloside from Psychotria serpens L.

HONG Ying-wen，LIANG Zi-ning，LIAO Gui-xiu，WEI Li-cui，LONG Qi-yun

（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract： HPLC was used to establish methods of content determi-nation of asperuloside in Psychotria serpens L.. Asperuloside as index components，on the basis of methanol concentration，liquid ratio and extraction time，we carried out experiments of single factor and orthogonal design to further optimize the extraction process. Optimum extraction of Glycyrrhizic flavonoids：70% methanol，solid-liquid ratio 1∶60，extraction time 30 min.

Key words： Psychotria serpens L.; asperuloside; extraction process

蔓九節（Psychotria serpens L.）又名穿根藤，为茜草科九节属植物[1]。性平，味苦、辛，归肝经，具有祛风湿，舒经活络，消肿止痛等功效，主要治疗风湿痹痛，腰肌劳损，坐骨神经痛，多发性痈肿，骨结核，跌打损伤，骨折，咽喉肿痛等症，是广西壮族民间常用草药[1-3]，常用全株治疗头痛、小儿疳积。车叶草苷是穿根藤中主要的活性成分，是一种环烯醚萜苷类化合物[4]，分子式为C18H22O11。车叶草苷具有抗菌、抗氧化、抗诱变、抗肿瘤和抗炎镇痛等药理作用[5，6]。药理研究表明，车叶草苷具体内外抗炎作用，其抗炎作用可能是通过抑制NF-кB的活化基因转录与蛋白表达，减少NO释放有关;并且车叶草苷在小鼠急性肺损伤病变的治疗中具有显著作用[7，8]。车叶草苷发挥抗炎作用的同时还伴随着镇痛作用[9]。

本研究通过3种提取工艺（冷浸提取法、超声提取法、回流提取法）的比较，以车叶草苷为指标，通过单因素试验、正交试验等对车叶草苷的提取工艺进行优化研究，为车叶草苷的开发和利用提供试验依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验材料  穿根藤药材分别采于广西壮族自治区不同产地，经广西中医药大学药用植物教研室梁子宁教授鉴定其为茜草科植物蔓九节Psychotria serpens L.的全株。

1.1.2  仪器与试剂  1260系列高效液相色谱仪（包括G-1311C高压四元泵，二极管阵列检测器，1260series色谱工作站，美国安捷伦科技公司）。车叶草苷对照品（上海士锋生物科技有限公司，批号18032716）。

1.2  方法

1.2.1  对照品的制备  精密称取车叶草苷对照品适量，加入甲醇溶液制成1 mL含0.623 mg的溶液，取上清液即得。

1.2.2  供试品的制备  取穿根藤粉末0.5 g，加70%甲醇溶液30 mL，超声提取30 min，滤过蒸干，甲醇溶液溶解定容至10 mL容量瓶中，13 000 r/min离心10 min，取上清液，作为供试液。

1.2.3  车叶草苷含量测定方法的建立

1）色谱条件。Agilent5TC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸（14∶86）为流动相，进样量10 μL，检测波长240 nm，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min。

2）标准曲线的制备。精密吸取上述车叶草苷对照品溶液（0.623 g/L）1 mL，分别置于1、5、10、25、50、100 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，配制系列车叶草苷对照品溶液。分别吸取上述6个浓度的溶液10 μL，按选定的色谱条件测定峰面积，以峰面积（x）为纵坐标，对照品溶液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=11 581.805 8x-59.339 292（r=0.999 73），线性范围0.006 23～0.623 g/L。

1.2.4  精密度试验  取同一车叶草苷对照品溶液（0.124 6 g/L），连续进样6次，车叶草苷峰面积的RSD为0.99%，表明仪器精密度良好。

1.2.5  稳定性试验  取穿根藤供试品溶液（CGT-1），于0、2、4、6、8、16、24 h分别进样10 μL测定，车叶草苷峰面积RSD为1.49%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

1.2.6  重复性试验  称取穿根藤药材干燥粉末（CGT-1）0.5 g，共6份，精密称定，测定并计算车叶草苷的含量，RSD为1.53%，表明该方法重复性良好。

1.2.7  加样回收率试验  精密称定已准确进行含量测定的穿根藤药材干燥粉末（CGT-1）0.25 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入车叶草苷对照品溶液（0.623 g/L）1.0 mL，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件测定，计算得平均加样回收率为100.72%，RSD为1.92%。

1.2.8  车叶草苷的提取工艺单因素试验

1）提取方法对车叶草苷提取率的影响。精密称取0.5 g穿根藤粉末3份，采用超声提取法、回流提取法、冷浸提取法对车叶草苷提取率进行工艺考察。

2）甲醇质量分数对车叶草苷提取率的影响。精密称取0.5 g穿根藤干燥粉末4份，分别以30%、50%、70%、100%质量分数的甲醇作为提取溶剂，超声提取1 h，过滤，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，进样量10 μL，测定峰面积，计算车叶草苷的含量。

3）提取时间对车叶草苷提取率的影响。精密称取0.5 g穿根藤粉末4份，在料液比为1∶50（g∶mL，下同），甲醇质量分数为100%的条件下分析提取时间分别为30、60、90、120 min时车叶草苷的提取率。

4）料液比对车叶草苷提取率的影响。精密称取0.5 g穿根藤粉末3份，以甲醇溶液为提取溶剂，提取时间为1 h的情况下，考察料液比对车叶草苷提取率的影响，料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶100。

1.2.9  正交试验  根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验表对甲醇溶液质量分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）进行3因素3水平正交试验，优化车叶草苷的最佳提取工艺，因素与水平如表1所示。

2  结果与分析

2.1  车叶草苷的提取工艺单因素试验

2.1.1  提取方法对车叶草苷提取的影响  精密称取0.5 g穿根藤粉末3份，采用超声提取法、回流提取法、冷浸提取法对车叶草苷提取率进行工艺考察，结果见图1。结果表明，冷浸和回流提取法的提取率比超声提取率大，但超声提取法成本较低、简便易行，综合考虑后选择超声提取法作为车叶草苷提取方法。

2.1.2  甲醇溶液质量分数对车叶草苷提取的影响  精密称取0.5 g穿根藤干燥粉末4份，分别以30%、50%、70%、100%的甲醇溶液作为提取溶剂，超声提取1 h。结果（图2）表明，随着甲醇溶液质量分数的增大，车叶草苷提取含量呈上升趋势。

2.1.3  提取时间对车叶草苷提取的影响  精密称取0.5 g穿根藤粉末4份，在料液比为1∶50，甲醇质量分數为100%的条件下分析提取时间分别为30、60、90、120 min时车叶草苷的提取含量。结果（图3）表明，当提取时间在30～90 min时，车叶草苷的提取含量随时间的增加而增加，当时间为90 min时提取含量最大，但当提取时间超过90 min后，随着时间的增加，提取含量逐渐下降。

2.1.4  料液比对车叶草苷提取的影响  精密称取0.5 g穿根藤粉末3份，以甲醇为提取溶剂，提取时间为1 h的情况下，考察料液比对车叶草苷提取含量的影响。料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶100。结果（图4）表明，料液比从1∶30至1∶60呈上升趋势，在1∶60达到最高，然后随着提取液增加提取含量减小。

2.2  车叶草苷的提取工艺正交优化

根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验对甲醇溶液质量分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）进行3因素3水平正交试验，优化车叶草苷的最佳提取工艺，试验结果及统计分析见表2和表3。

以车叶草苷含量为指标，则影响程度依次为A>B>C。A、B因素对提取率有显著影响，C因素无显著影响。方差分析显示R1>R2>R3。结果表明，提取溶液质量分数为最主要因素，料液比次之，提取时间的影响最小，最佳提取条件为A2B3C3，即甲醇溶液质量分数70%、料液比1∶60、提取时间90 min。

2.3  车叶草苷提取的工艺验证

为进一步确定最佳提取条件，对正交试验分析得到的车叶草苷提取最佳的条件进行验证性试验，结果见表4。验证试验结果显示，两个不同提取条件下A2B3C3提取方法的车叶草苷含量稍大于A2B3C1，但总体差异不大，从节省时间、降低成本的角度考虑，综合比较后确定最佳提取工艺为70%甲醇溶液、料液比1∶60、提取时间30 min。

3  讨论

穿根藤中主要成分有环烯醚萜苷类、黄酮类和三萜类成分，其中环烯醚萜苷类主要有车叶草苷。研究表明环烯醚萜苷类成分具有抗肿瘤和抗病毒、抗抑郁、抗炎镇痛、抗阿尔海默病、抗休克、抗肥胖以及保护心血管等作用[10]。车叶草苷具有抗菌、抗氧化、抗诱变、抗肿瘤和抗炎镇痛等药理作用[11，12]。穿根藤具有的舒经活络、祛风止痛等功效与车叶草苷的抗炎镇痛、抗氧化和抗癌等作用相关。因此，本研究以车叶草苷含量为主要评价指标。车叶草苷作为穿根藤抗炎有效成分的作用机制则有待另文报道。

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收稿日期：2019-02-11

基金项目：广西壮瑤药重点实验室项目（桂科基字[2014]32号）;广西重点学科壮药学项目（桂教科研[2013]16号）;壮瑶药协同创新中心

项目（桂教科研[2013]20号）

作者简介：洪影雯（1994-），女，广西北海人，硕士，研究方向为中药及民族药品种、品质及资源开发，（电话）18376648556（电子信箱）

604217976@qq.com;通信作者，梁子宁，教授，硕士生导师，主要从事中药及民族药品种、品质及资源开发研究，（电话）18154515865

（电子信箱）381668307@qq.com。