血清miR-9和miR-155表达在HPV阳性宫颈癌诊断和预后中的临床价值

秦艳

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其中人类乳头瘤病毒(HPV)感染是发生宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的重要因素，其通过复杂的多阶段和多基因突变等异常调控的过程[1]。在HPV感染的患者中发生CIN的风险为28%，而在10年内发生宫颈癌的几率为3%。单一的HPV感染并不一定发展为宫颈癌，与机体的免疫和基因改变具有明显的相关性[2]。微小RNA(miRNA)在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用，是一种非编码小分子RNA，参与肿瘤的发生发展过程，对于诊断和预后判断具有重要的临床意义[3]。miR-9作为一个癌基因受到较高的关注，在多种肿瘤中具有诊断和预测肿瘤预后的功能，而其靶基因在宫颈癌的机制研究仍较少[4]。miR-155在多种恶性肿瘤发生发展具有重要作用，在不同肿瘤中可以表现为癌基因和抑癌基因的作用[5]。本组研究通过联合血清miR-9和miR-155表达在HPV阳性宫颈癌表达，观察其在宫颈癌患者早期诊断和预测预后的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015至2017年在我院诊治的HPV阳性的宫颈癌患者119例，为宫颈癌组，年龄35～60岁，平均年龄(43.65±9.16)岁；体重指数(BMI)(22.38±3.15)kg/m2；病理分型：鳞癌106例，腺癌13例；分化程度：高分化10例，中分化98例，低分化11例；临床分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期54例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例；淋巴结有转移21例，无转移98例。选择同期在我院HPV阳性子宫内瘤变的患者75例，为CIN组，年龄35～60岁，平均年龄(42.93±8.46)岁；BMI(22.38±3.15)kg/m2；选择同期在我院就诊HPV阳性良性宫颈病变或者单纯HPV阳性者45例为对照组，年龄35～60岁，平均年龄(43.67±8.69)岁；BMI(21.96±3.27)kg/m2。3组在年龄和BMI方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：宫颈癌组，CIN组和对照组均HPV阳性，并且符合相关的诊断标准；均知情同意签字，经医院伦理委员会通过。

1.2.2 排除标准：合并其他肿瘤；合并血液性和免疫性疾病；参与其他临床实验者；接受放疗，化疗和生物治疗的患者。

1.3 方法

1.3.1 血液标本采集：患者入院后清晨空腹肘静脉血约10 ml，在4℃的条件下放置30 min，低速离心20 min，离心速度1 800 r/min，离心半径为15 cm，离心后去上清液，将其保存在-70℃冰箱中保存。

1.3.2 miRNA提取和逆转录反应：根据miRNeasy提取试剂盒的说明书提取miRNA，并通过紫外分光度将吸光度的比值在1.8～2.0的标本保存用于后续检测，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反转录试剂盒的使用说明书将miRNA反转录为cDNA，标本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR检测：根据GenBank中的miR-9，miR-155和U6的序列号，并用Premier Primer5.0软件进行引物设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-9引物序列，上游：5’-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGT-3’,下游：5’-CTCAACTGGTGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3’，miR-155的引物序列，上游：5’-CCCTCGAGAGCTCCTTCCTTTCAACAG-3’,下游：5’-CCAAGCTTCCCAGTGACCAGATTATGA-3’和U6引物序列，上游：ATCCGCAAAGACCTGT，下游：GGGTGTAACACTAAG。qRT-PCR的总反应体系为25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(浓度10 μmmol/L)，cDNA为0.8 μl，RNase H2O为12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反应条件为：预变性温度95℃10 min，95℃和60℃分为5 s和60s，总共进行40个循环。在60℃用ABI7700软件收集荧光信号进行溶解曲线分析，每个样品进行3个平行复孔，相对表达量采用表示2-ΔΔCt，公式表达为ΔΔCt=试验组(Ct目标基因-CtU6)-对照组(Ct目标基因-CtU6)。

1.3.4 观察指标：比较宫颈癌组，CIN组和对照组血清miR-9和miR-155表达量，观察宫颈癌患者血清miR-9和miR-155表达与临床指标和诊断宫颈癌的临床价值，比较血清miR-9和miR-155表达水平与宫颈癌死亡的关系及评价死亡的临床价值。

2 结果

2.1 3组血清miR-9和miR-155表达比较 宫颈癌组的血清miR-9和miR-155表达明显高于CIN组和对照组(P<0.01)，而CIN组的表达水平明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

组别MiR-9(2-ΔΔCt)MiR-155(2-ΔΔCt)宫颈癌组(n=119)6.30±1.90∗#16.51±5.01∗#CIN组(n=75) 4.01±1.22∗10.31±4.10∗对照组(n=45) 2.36±0.976.71±2.38F值134.176115.280P值0.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.01；与CIN组比较，#P<0.01

2.2 血清miR-9和miR-155表达与宫颈癌患者临床指标的关系 宫颈癌患者血清miR-9和miR-155表达与年龄，病理分型，分化程度和肿瘤直径无明显相关性(P>0.05)，而与临床分期，淋巴转移，间质浸润深度，累及阴道壁，累及宫旁组织和累及血管间隙具有明显相关性(P<0.01)。见表2。

2.3 宫颈癌患者血清miR-9和miR-155表达在诊断宫颈癌的诊断效能 血清miR-9和miR-155表达水平在诊断宫颈癌方面具有较高的灵敏度和特异性，将上述两指标是否为宫颈癌通过二元回归分析，联合指标(miR-9+miR-155)具有明显的线性关系，得回归方程0.951XmiR-9+0.391XmiR-155-9.260，并发现联合检测的曲线下面积为0.909，灵敏度为82.4%，特异度82.7%，在诊断宫颈癌方面明显优于单独miR-9(Z=2.864，P=0.004)和miR-155(Z=4.156，P=0.000)，而两个指标之间的曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图1。

临床指标miR-9(2-ΔΔCt)t(F)值P值miR-155(2-ΔΔCt)t(F)值P值年龄(岁)0.2430.8080.5360.593 <45(n=56)6.34±1.86 16.75±4.35 ≥45(n=63)6.26±1.73 16.30±4.76 病理分型0.1820.8560.1960.845 鳞癌(n=106)6.29±1.68 16.48±4.68 腺癌(n=13)6.38±1.75 16.75±4.73 临床分期3.7740.00010.8530.000 Ⅰ～Ⅱ期(n=99)6.05±1.58 14.35±4.86 Ⅲ～Ⅳ期(n=20)7.54±1.76 27.20±4.67 分化程度0.5360.5640.1850.790 高(n=10)6.28±1.68 15.86±4.76 中(n=98)6.34±1.56 16.51±4.57 低(n=11)5.96±1.75 17.10±4.52 肿瘤直径(cm)0.5120.6091.3420.182 >4(n=53)6.39±1.71 15.86±4.82 ≤4(n=66)6.23±1.68 17.03±4.65 淋巴结转移4.5840.0003.3920.001 是(n=21)7.88±1.65 19.73±4.86 否(n=98)5.96±1.76 15.82±4.78 间质浸润深度5.1580.0003.0700.003 <2/3(n=72)5.68±1.55 15.43±4.66 ≥2/3(n=47)7.25±1.73 18.17±4.91 累及阴道壁5.6820.0002.8980.005 有(n=21)8.07±1.77 19.25±4.82 无(n=98)5.92±1.53 15.92±4.77 累及宫旁组织6.6990.0004.0660.000 有(n=13)9.16±1.72 21.52±4.65 无(n=106)5.95±1.62 15.90±4.71 累及血管间隙8.8770.0004.8000.000 有(n=37)8.35±1.71 19.57±4.76 无(n=82)5.38±1.68 15.13±4.63

表3 联合血清miR-9和miR-155表达在诊断宫颈癌的效能

2.4 宫颈癌患者血清miR-9和miR-155表达与预后的关系 宫颈癌死亡组血清miR-9和miR-155表达水平明显高于生存组(P<0.01)。见表4。

2.5 血清miR-9和miR-155表达水平在预测死亡的效能 血清miR-9和miR-155表达水平在预测宫颈癌死亡方面具有较高的灵敏度和特异性，将两个指标是

图1 联合血清miR-9和miR-155表达在诊断宫颈癌的曲线下面积

组别miR-9(2-ΔΔCt)miR-155(2-ΔΔCt)生存组(n=86)5.60±1.5014.58±3.83死亡组(n=33)8.12±1.6221.53±4.22t值8.0248.613P值0.0000.000

否为宫颈癌通过二元回归分析，联合指标(miR-9+miR-155)具有明显的线性关系，得回归方程1.042XmiR-9+0.440XmiR-155-16.027，并发现联合检测的曲线下面积为0.958，灵敏度为97.0%，特异度87.2%，在预测死亡方面明显优于单独miR-9(Z=2.376，P=0.018)和miR-155(Z=2.048，P=0.041)，而两个指标之间的曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)。见表5，图2。

表5 联合血清miR-9和miR-155表达水平在预测死亡的效能

图2联合血清miR-9和miR-155表达水平在预测死亡的曲线下面积

3 讨论

miRNAs是基因调控网络中的重要组成部分，参与多种信号通路的进行调控。现有研究表明，miRNAs参与了肿瘤细胞的增殖，迁移，分化和凋亡等过程[6]。研究显示，在宫颈癌发病过程中，具有多种miRNAs异常表达，并且认为miRNAs可能参与了宫颈癌的发生发展过程，尤其在早期诊断宫颈癌，改善预后方面具有较高的临床价值[7]。miRNAs可以在稳定和丰富的形式存在于体液中，如果以血液作为载体对肿瘤进行检测，不仅可以摆脱对原发组织的依赖，而且为肿瘤的早期诊断提供一条无创，便捷的新途径。

本组研究证实表明宫颈癌患者血清miR-9表达水平明显高于CIN组和对照组，与文献报道宫颈癌患者出现miR-9高表达一致，并且发现血清miR-9表达水平在诊断宫颈癌诊断中具有较高的特异性，当血清相对表达>4.971时，其灵敏度为75.6%，特异性为81.3%，曲线下面积为0.485，说明血清miR-9表达水平对诊断宫颈癌具有一定的参考价值。本组研究还发现宫颈癌患者血清miR-9表达与与临床分期，淋巴转移，间质浸润深度，累及阴道壁，累及宫旁组织和累及血管间隙具有明显相关性(P<0.05)，说明血清miR-9表达一定程度反映宫颈癌患者的恶性程度，是反映宫颈癌预后的指标。现已知miR-9在多种恶性肿瘤中出现异常表达，在乳腺癌胆管癌，肝癌和直肠癌呈高表达，而在胃癌，卵巢癌和肾细胞癌为低表达[8]。在一项对宫颈癌的研究中，利用芯片技术对宫颈癌组织检测发现出现15个miRNAs上调和10 miRNAs下调，而miR-9在宫颈癌组织中出现明显上调[4]。在一项miR-9对肿瘤细胞信号转导通路影响的研究发现miR-9能够调节肌动蛋白骨架，细胞黏附信号和脂质代谢等重要过程具有密切联系[9]。本组研究还发现宫颈癌患者死亡组血清miR-9表达明显高于生存组，并且发现宫颈癌患者血清miR-9表达在预测死亡方面具有较高的特异性和灵敏度，说明血清miR-9表达是宫颈癌预后的重要指标，与文献报道[10]miR-9与宫颈癌预后具有密切相关。

本组研究表明宫颈癌患者血清miR-155表达明显高于CIN组和对照组，并且发现其在诊断宫颈癌效能方面具有较高的灵敏度和特异性，与文献报道miR-155基因相当于癌基因作用，其定位于21q21.3，参与肿瘤增殖和迁移的关键关节之一，在乳腺癌和胰腺癌等肿瘤细胞的生长，增殖，免疫逃逸和化疗耐药具有重要作用[11]。本组研究发现宫颈癌患者血清miR-155表达与临床分期，淋巴转移，间质浸润深度，累及阴道壁，累及宫旁组织和累及血管间隙具有明显相关性(P<0.05)，说明miR-155的表达预测宫颈癌恶性程度具有重要作用。在一项宫颈癌患者血清miR-155表达水平在诊断宫颈癌效能方面明显优于传统的指标如CA125和鳞状细胞癌抗原，具有较高的特异性，认为作为鉴别HPV阳性宫颈癌和CIN方面具有重要的临床价值，并认为可以作为监测宫颈癌发生发展和诊断HPV阳性宫颈癌的重要标记物[12]。miR-155基因在不同肿瘤中具有不同的作用，miR-155基因在乳腺癌中具有明显抑制增殖和转移，作为抑癌基因[13,14]；而在肺癌的形成过程中具有促进作用，并在肿瘤的转移过程中具有决定性作用[15,16]。本组研究还发现宫颈癌死亡组患者血清miR-155表达明显高于生存组(P<0.05)，并发现血清miR-155在预测宫颈癌死亡方面具有较高的特异性和灵敏度，是宫颈癌预后的重要基因。本组研究发现联合检测宫颈癌血清miR-9和miR-155表达在诊断宫颈癌较高的特异性和灵敏度，并且发现其曲线面积明显高于单个基因miR-9和miR-155的诊断效能，说明联合检测在提高诊断效能方面具有重要价值。在预测宫颈癌死亡方面，联合检测宫颈癌患者血清miR-9和miR-155表达具有更高的灵敏度和特异性，其曲线下面积明显优于单个基因表达，能够提高预测预后不良的效能。