秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠凋亡及Wnt/β-catenin通路的影响

邢德君 孙庆霞 (吉林省肿瘤医院内三科，吉林 长春 30000；吉林省前卫医院检验科)

受大气污染、环境致癌物及吸烟人群等因素的影响，肺癌的发病率逐年增加，其发病率及病死率均居于各类肿瘤的前列，危害巨大〔1〕。肺癌晚期患者的治疗主要为化疗、放疗及靶向治疗，其中化疗选择性较差，对人体正常细胞也有较大的影响，易产生恶心呕吐、骨髓抑制、肝肾功能损害等诸多反应；放疗也会导致放射性肺炎、放射性脊髓病、放射性食管炎、放射性心包炎等危害；而靶向治疗目前只有少数受体阳性的肺癌患者才能采用，其疗效也有待于进一步评估〔2〕。因此，寻找对肺癌敏感的药物是医务人员及科研工作者始终关注的焦点问题。

秦皮乙素是从柠檬叶、苦枥白蜡树树皮、地黄、曼陀罗、颠茄等植物中提取的单体成分，又称6，7-二羟基香豆素，为香豆素的衍生物。现已发现，秦皮乙素具有治疗糖尿病、肠道疾病、保肝、化痰平喘、抗氧化、抗菌及抗炎等多种活性〔3〕。近年来，秦皮乙素在肿瘤治疗中的应用得到广泛重视，其对白血病、骨髓瘤、脑胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肠癌、胰腺癌、肝癌及胃癌等均有治疗作用〔4〕。秦皮乙素对人肺癌H460细胞也有一定的抑制作用，但相关研究仅局限于体外实验，且作用机制并未阐明〔5〕。本研究选择Lewis肺癌小鼠模型，在秦皮乙素抗肺癌作用的基础上，探讨其与凋亡及Wnt/β-catenin通路的相关性，旨在为临床肺癌的治疗寻找新的低毒、高效的化疗药物。

1 材料与方法

1.1细胞与动物 小鼠Lewis肺癌细胞，购于美国ATCC公司，培养于DMEM培养液中(含10%胎牛血清)。雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，SPF级，购于吉林大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(吉)2016-0001；自由饮水，常规饲养。

1.2药品与试剂 秦皮乙素〔高效液相色谱法(HPLC)>90%〕，南京道斯夫生物公司，批号：20180225；顺铂注射液，南京制药公司，批号：20171109；胎牛血清及DMEM培养液，美国Gibco公司；Annexin-V-异硫氨酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒，美国BD公司；逆转录试剂盒，上海生科公司；实时定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒，美国BD公司；caspase3、8和9活性测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；β-catenin，Cyclin D1、c-Myc抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗，上海碧云天公司。

1.3主要仪器设备 分析天平(FA2004B)，上海精科公司；CO2培养箱(BPN-150RHP)，上海一恒仪器公司；倒置显微镜(IX53)，日本奥林巴斯公司；流式细胞仪(FACSCanto Ⅱ)，美国BD公司；实时荧光定量PCR仪(StepOne TM)，美国ABI公司；紫外/可见分光光度计(6010)，上海惠普仪器公司。

1.4建立小鼠Lewis肺癌模型 将冻存的Lewis肺癌细胞复苏并培养至对数生长期，在C57BL/6小鼠背侧皮下接种(0.2 ml)，2 w后，脱颈处死小鼠。常规消毒，将肿瘤组织剥离，于无菌平皿中剪碎，在组织研磨器中研磨；加入适量4℃生理盐水，调整Lewis肺癌细胞液浓度为1×107/L。小鼠右腋皮下注射将上述细胞液0.2 ml以建立小鼠Lewis肺癌模型。

1.5分组及给药 随机分为模型组、顺铂组、秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组各12只。顺铂组(1 mg/kg)腹腔注射给药，秦皮乙素高剂量组(100 mg/kg)及秦皮乙素低剂量组(50 mg/kg)灌胃给药，模型组灌胃等体积溶媒；造模后第2天开始给药，1次/d，共14 d。

1.6瘤质量及抑瘤率测定 在末次给药的次日，处死小鼠，无菌条件下将肿瘤组织剥离。用预冷的生理盐水冲洗，并经滤纸拭干后，称量瘤质量；按照公式计算抑瘤率。抑瘤率=(1-药物组瘤质量/模型组瘤质量)×100%。

1.7凋亡率测定 常规方法制备瘤组织单细胞悬液，并用磷酸盐缓冲液调整细胞密度为1×106个/ml，取100 μl细胞悬液至于1.5 ml离心管中。向离心管中再加入PI和Annexin-V-FITC溶液各5 μl，避光4℃条件下放置30 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8Bax及Bcl-2 mRNA表达测定 取剪碎后的瘤块组织，Trizol法提取瘤块组织总RNA，逆转录法合成cDNA，引物序列信息如表1所示，由大连宝生物工程有限公司合成。采用实时定量PCR法测定Bax及Bcl-2 mRNA表达水平。扩增条件为：96℃，预变性5 min；96℃变性30 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共计35个循环。以β-actin为内参基因，采用2-△△Ct法对所得数据进行定量分析。

表1 引物序列信息

1.9caspase3、8和9活性测定 取剪碎后的瘤块组织，在冰上加入预冷的裂解缓冲液，制备10%匀浆液。离心(10 000 r/min，5 min)，收集上清液，备用。利用紫外/可见分光光度计，按照试剂盒说明书中的操作步骤，检测瘤组织caspase3、8和9活性。

1.10Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达测定 取1.9中的10%瘤组织匀浆上清液，采用Western印迹法测定秦皮乙素对荷瘤小鼠瘤组织β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达的影响。二喹啉酸法测定上清液总蛋白浓度后，按比例将上清液与上样缓冲液混合，加热煮沸10 min进行变性。加入20 μl蛋白样品于加样孔中，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。依次进行转膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、显色及曝光等操作后；通过与内参蛋白β-actin比较，分析目的蛋白的相对表达水平。

1.11统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠瘤质量及抑瘤率的影响 与模型组比较，顺铂组、秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组瘤质量均显著降低(均P<0.05)；与顺铂组比较，秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组瘤质量均显著增加(均P<0.05)。见表2。

表2 各组瘤质量及抑瘤率

与模型组比较：1)P<0.05；与顺铂组比较：2)P<0.05；下表同

2.2秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡率的影响 与模型组〔(8.75±1.23)%〕比较，顺铂组、秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组肿瘤细胞凋亡率〔(42.14±6.31)%、(33.46±5.80)%、(20.82±3.79)%〕显著增加(P<0.05)；与顺铂组比较，秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组肿瘤细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)，且秦皮乙素高剂量组诱导凋亡效果优于秦皮乙素低剂量组。见图1。

2.3秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Bax及Bcl-2 mRNA表达的影响 与模型组比较，顺铂组、秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组肿瘤组织Bax mRNA表达显著增加，而Bcl-2 mRNA表达显著降低(均P<0.05)；与顺铂组比较，秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组肿瘤组织Bax mRNA表达显著降低，而Bcl-2 mRNA表达显著增加(均P<0.05)。见表3。

2.4秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织caspase3、8和9活性的影响 与模型组比较，顺铂组、秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组caspase3、8和9活性均显著增加(均P<0.05)；与顺铂组比较，秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组caspase3、8和9活性均显著降低(均P<0.05)。见表3。

2.5秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响 与模型组比较，顺铂组、秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达被明显抑制，表达量均显著降低(均P<0.05)；与顺铂组比较，秦皮乙素高剂量组及秦皮乙素低剂量组β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达均显著增加(均P<0.05)。见表4和图2。

图1 秦皮乙素对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡率的影响

组别BaxBcl-2caspase3(U/mg)caspase8(U/mg)caspase9(U/mg)模型组0.41±0.050.74±0.090.54±0.070.45±0.050.24±0.02顺铂组1.13±0.201)0.23±0.031)1.87±0.221)0.98±0.131)0.62±0.071)秦皮乙素高剂量组0.97±0.141)2)0.32±0.041)2)1.69±0.151)2)0.77±0.081)2)0.56±0.061)2)秦皮乙素低剂量组0.86±0.111)2)0.59±0.081)2)1.31±0.211)2)0.62±0.091)2)0.45±0.041)2)

表4 各组肿瘤组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达

图2 Western印迹检测秦皮乙素各组肿瘤组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达

3 讨 论

肿瘤细胞凋亡过程受阻是肿瘤发生的重要因素〔6〕。本研究提示秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长与诱导凋亡作用有关。Bcl-2基因家族在线粒体通路调控细胞凋亡进程中有关键性重要作用，其中Bax和Bcl-2是功能截然相反的两个基因，Bax可促进细胞发生凋亡，而Bcl-2主要抑制细胞凋亡进程，二者共同调控线粒体功能介导的细胞凋亡〔7〕。本研究证明秦皮乙素可诱导Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞发生凋亡。秦皮乙素还可抑制肺瘤小鼠肿瘤组织caspase3、8和9的活性。caspase3的活化标志着凋亡进入不可逆阶段，是细胞凋亡的主要效应分子，为caspase家族中最为重要的凋亡执行者〔8〕。caspase8具有活化下游caspase3、6和7的作用，而caspase9可以与凋亡相关因子1结合聚合形成凋亡小体，进而诱导细胞发生凋亡〔9〕。本研究结果表明，秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的作用与诱导凋亡有关。Wnt信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路、平面细胞极性信号通路及Wnt/Ca2+信号通路，其中经典的Wnt/β-catenin信号通路参与调控肿瘤细胞的凋亡、周期及增殖等过程〔10〕。研究表明〔11〕，Wnt/β-catenin信号通路的异常活化与肺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌等相关，其中Wnt信号通路中最关键的转导因子β-catenin，参与调控细胞凋亡、分化、生长及黏附等过程。β-catenin活化后，下游Cyclin D1、c-Myc等效应分子表达增加，导致肿瘤发生〔12〕。另有研究表明〔13〕，肺癌与Wnt/β-catenin信号通路关系密切，可影响肺癌的恶性程度，决定着患者生存与预后情况。因而，Wnt/β-catenin信号通路可作为肺癌治疗的靶点，抑制该通路的激活，可起到抗肺癌作用〔14〕。本研究表明秦皮乙素具有抑制Wnt/β-catenin通路活化的作用。综上，秦皮乙素可通过诱导凋亡及抑制Wnt/β-catenin通路激活，发挥抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的作用，但具体机制还有待于深入研究。