灰霉菌侵染对番茄幼苗活性氧积累及抗氧化酶活性的影响

何 娟，潘光军，官涵杰，陆光磊，陈江艳，须 文

（贵州大学农学院园艺系，贵州 贵阳 550025）

灰霉病是由葡萄孢属（Botrytisspp.）真菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，在我国各蔬菜种植区均有发生，造成巨大的经济损失[1]。番茄（Solanum lycopersicumL.）是世界第一大蔬菜作物，根据世界粮农组织统计显示，全球每年番茄总产值接近1 000亿美元，在蔬菜和水果中居于首位。番茄在种植过程中容易发生多种病害，主要有早疫病、青枯病、晚疫病、病毒病、灰霉病、线虫病、细菌性斑点病等。随着番茄种植面积的不断扩大以及连作，番茄病害发生加重，而且是多种病害同时发生，给防治加大了难度。番茄灰霉病是造成保护地番茄减产的主要原因之一[2]，目前生产上主要以农药防治为主，但存在着农药残留及环境污染的问题。

植物体内的可溶性蛋白是指存在于细胞中的由多种酶系构成的非膜结合蛋白体系，可以以小分子状态溶于水或其他蛋白，大多数是参与各种代谢的酶类，其含量是了解植物总体代谢的一个重要指标。在植物遭受盐害、低温、高温、干旱等逆境时，都以可溶性蛋白的含量高低为指标，是植物产生抗性基因最直观的鉴定指标。

活性氧（ROS）迸发被认为是过敏反应的特征性反应，可以由生物或者非生物因素诱发，也是植物对病原菌应答的最早期反应之一，在植物的防卫反应中起到重要的作用[3-4]。ROS本身作为一个信号分子，可以直接或间接地激活抗性基因和植物防卫基因的表达，从病原菌开始侵染植株到植物获得系统获得性抗性（SAR），这实质是一个连续的信号传递过程[5]。ROS作为这个信号链上的一个信号参与SAR的形成。此时，ROS可能起到双重作用，其在高浓度时对植物起到伤害作用，低浓度时起到传递信号作用，并且诱导植物体内抗性基因和防卫基因的表达[6]。研究发现ROS作为信号分子，在诸如植物生长、发育、激素信号等过程中也起到重要的作用[7]。

在植物体中均有活性氧产生和清除的机制。植物体内存在能够分解ROS的酶系以及多种生物抗氧化剂，共同组成了一个ROS防御体系[8]，使ROS的产生与清除处于一种动态平衡状态，保护机体正常细胞组织免受破坏。在植物体内发生ROS迸发后，酶系统行使对ROS的清除作用，在这其中起主要作用的是超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸/谷胱甘肽循环酶系统、谷胱甘肽过氧化物酶系统、硫氧还蛋白系统。SOD是植物代谢的关键酶之一[9]。非酶促清除系统主要是指植物体内所含的抗氧化物质。目前，发现植物体内抗氧化物质主要包括抗坏血酸、维生素E、卟啉类化合物、类胡萝卜素、酚类化合物、甘露醇及还原性谷胱甘肽等[10]。这些物质既可直接在消除ROS中起作用，又可作为酶的底物在活性氧的清除中发挥重要作用。逆境胁迫能够促进植物自身合成褪黑素。褪黑素广泛存在于植物体内，对植物生长和发育方面有着重要的作用[11]。

本试验以番茄幼苗为试验材料，比较番茄幼苗受灰霉菌侵染后的叶片超氧阴离子自由基活性氧成分以及抗氧化酶、内源褪黑素等的变化，为进一步分析活性氧和抗氧化防御系统在番茄的抗病信号调控机制中的作用，提高产量和品质提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为番茄品种浙杂809，购于浙江浙农种业有限公司。供试番茄灰霉菌由浙江大学蔬菜研究所师恺教授惠赠。

1.2 试验设计

试验设置2个处理：番茄幼苗接种灰霉病菌菌液处理（记为灰霉菌），以番茄幼苗接种纯净水为对照处理（记为CK）。

1.3 试验方法

1.3.1 幼苗培养

试验在贵州大学农学院园艺专业基础实验室进行。番茄种子温汤浸种15 min后冷却至室温，继续浸种12 h，然后置于28 ℃的恒温箱中催芽，中间翻动种子2～3次，2～3 d种子露白后，将发芽的番茄种子播种在草炭、蛭石和珍珠岩体积比为3∶1∶1的混合基质中。当番茄幼苗长至2叶1心时，移苗至装有同样基质的塑料营养钵中，每钵1株。生长环境条件如下：温度为25 ℃/20 ℃（白天/晚上），相对湿度控制在70%左右，光周期为14 h/10 h（光/暗）、平均光强约300 μmol/（m2·s）。每3 d用“N-P2O5-K2O+TE”为“20-20-20+TE”的水溶肥稀释1 000倍后浇灌幼苗。当幼苗4叶1心时进行活体接种灰霉菌处理。

1.3.2 样品处理、采集与测定

番茄长到4叶1心时，选取生长健康、长势一致的番茄幼苗进行灰霉菌接种。接种方法是用浓度为2×105cfu/mL的灰霉菌孢子悬浮液进行叶面、主茎部位均匀喷施，以空白悬浮液作为对照，每处理20株番茄。试验设重复3次。接种后保持空气湿度90%以上，分别于接种后1、2、3 d观察植株发病表型并取样测定叶片灰霉病菌含量、活性氧、抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量等。取样时取植株上层成熟完整叶片，混合取样。

1.3.3 测定方法及原理

植株发病表型：灰霉Actin的相对表达量是一个能表征番茄叶片中灰霉病菌含量的指标，Actin基因前引物序列为：ACTCATATGTTGGAGATGAAGCGCAA；后引物序列为：AATGTTACCATACAAATCCTTACGGACA。以番茄Actin基因表达水平作为内参，相对基因表达水平的计算参照Livak[12]的方法计算。

可溶性蛋白的含量使用牛血清蛋白作为标准，测定方法参考Bradford[13]的方法。SOD、POD、CAT和谷胱甘肽还原酶（GR）的测定方法参考Xia等[14]的方法。使用紫外分光光度计进行吸光度（OD值）的测定分析。褪黑素的含量测定采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA法）。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算样品浓度。超氧阴离子自由基（O2-·）产生速率的测定采用羟胺氧化法[15-16]。

1.3.4 数据分析

利用Excel 2010、DPS和Origin软件进行试验数据的统计、整理、分析和做图。

2 结果与分析

2.1 灰霉菌侵染后的番茄幼苗叶片表型变化分析

由侵染观测结果可知，番茄幼苗接种灰霉菌孢子悬浮液1 d后叶片表面可以看到少量棕褐色病斑点，2 d后叶尖部区域开始出现明显的点状黑褐色病斑，有明显的水浸状。侵染3 d后番茄整个叶片出现大量棕褐色斑点，极其明显。对照处理无明显表型变化。试验表明，接种灰霉病菌后，番茄植株下部叶片稍黄于对照处理的植株下部的叶片，叶柄处多处有不规则褐色病斑。随着侵染后时间的延长，病斑斑点逐渐增多，叶色逐渐变浅。

2.2 番茄叶片的灰霉菌含量变化分析

灰霉Actin的相对表达量是一个能表征番茄叶片中灰霉病菌含量的指标。由图1可知，在灰霉菌侵染后，番茄叶片的灰霉菌含量随时间的延长而增多，侵染2、3 d的叶片灰霉菌含量分别是侵染1 d的3.1、5.9倍。叶片灰霉病菌含量的变化与叶片发病表型相一致。

2.3 番茄叶片的可溶性蛋白含量变化分析

结果表明：番茄叶片可溶性蛋白的含量在灰霉菌侵染后3 d内有所增加，但是新复极差比较发现，灰霉菌侵染各处理之间可溶性蛋白的含量没有显著差异，如图2所示。

2.4 番茄叶片O2-·的含量变化分析

在环境胁迫下，细胞内生物自由基代谢平衡被破坏，造成O2-·积累，进而引发或加剧膜脂过氧化作用，使得细胞膜系统的结构和功能劣变，新陈代谢发生紊乱。如图3所示，番茄幼苗受到灰霉病菌侵染后O2-·的含量增加，侵染后3 d叶片O2-·的含量达到1.6 nmol/mg，是对照的2.9倍。活性氧O2-·加剧细胞膜损伤，破坏DNA、蛋白质和脂类等分子结构。

2.5 番茄叶片抗氧化酶活性分析

如图4所示，番茄幼苗受到灰霉病菌侵染后1 d叶片SOD活性显著减小，为4.0 U/mg，只达到对照的71.25%。而侵染2 d后幼苗叶片SOD活性又显著增大，与对照一致。侵染后第3天叶片SOD活性又有所下降，但是没有达到显著水平。受到灰霉病菌侵染2 d后番茄幼苗叶片的POD活性继续下降，达到0.22 U/mg，是对照的56.7%。随着灰霉病菌侵染后时间的延长，叶片POD活性继续下降，对照处理的叶片POD活性小幅下降（图5）。受到灰霉病菌侵染后番茄幼苗叶片CAT活性显著高于对照，侵染后1、3 d叶片CAT活性分别是0.04、0.05 μmol/（mg·min），分别是对照的1.86倍和1.56倍，但新复极差检验结果表明，两者之间差异并不显著（图6）。受到灰霉病菌侵染后番茄幼苗叶片GR活性显著高于对照，侵染后1、2、3 d叶片GR活性之间差异显著，分别达到0.19、0.25、0.40 μmol/（mg·min），分别是对照的1.17、1.58、2.55倍（图7）。上述结果说明，灰霉菌侵染引起的生物胁迫并不一定导致SOD、CAT和POD 活性的上升，不能以此来判断植物对逆境的响应能力和抗逆境能力的强弱。

2.6 番茄叶片的褪黑素含量分析

如图8所示，番茄幼苗在接种灰霉病菌后1 d叶片褪黑素含量增加，但是随着时间的延长，褪黑素含量不再显著增加。侵染后1 d叶片褪黑素含量是15.5 ng/g，是对照的1.1倍，侵染后3 d叶片褪黑素含量是15.8 ng/g，是对照的1.08倍。由此可知，褪黑素作为一种抗氧化物质，在番茄幼苗受到灰霉菌侵染的早期被诱导增加，有助于清除活性氧。

3 结论与讨论

在本试验中，灰霉菌侵染后叶片O2-·积累增多，CAT和GR的活性是升高的，其变化趋势与SOD、POD是不同的。由此可以说明，灰霉菌侵染引起的生物胁迫不能简单地根据SOD、CAT和POD 的活性值绝对高低来判断植物对逆境的响应能力和抗逆境能力的强弱；但是在胁迫条件下，如果能提高植物的保护酶系统活性，清除活性氧自由基的能力增强，就能减轻伤害。

综合以上结果得出：番茄幼苗受到灰霉菌侵染后植株逐渐发病，叶片病斑逐渐增多，体内超氧阴离子自由基等活性氧爆发，SOD和POD活性下降，CAT和GR活性上升，抗氧化物质褪黑素含量增加，上述变化都是番茄幼苗为了抵御灰霉菌的生物胁迫而发生的应激反应，但不是所有抗氧化酶活性都升高。所以植物在遭受病原菌等生物胁迫时不能简单地推断SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性一定升高，植物抵御病原菌侵染更多地依赖于抗性信号路径中信号物质的激活和积累。