不同酶消化液对大鼠肺微血管内皮细胞分离培养的影响

李佩珊，张志欢，孙 雄,2，吴显平，张永红*，张 涛

(1.北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206；2.中牧实业股份有限公司，北京 100070)

细胞的原代培养具有广泛的生物学意义，关键的一步便是获得需要的原代细胞。酶消化是当前获得所需原代细胞最常用的方法，选择对组织的解离效果好、损伤小的酶消化液，是获得高活力细胞的重要环节。微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells，MVECs)因在机体多种生理过程和病理变化中起关键作用[1]，其体外培养模型越来越多的应用于相关研究。肺MVECs由于传代培养性能差，试验研究中需经常进行原代培养，早期组织块贴壁法较为常用[2]，而近年来酶消化法的应用日益增多，但所用的酶消化液种类不尽相同，例如，0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA混合溶液[3]、胶原酶IV溶液[4]、0.2%胶原酶II溶液[5]、0.6%胶原酶P和2.1%分散酶[6]等。

虽然各种酶的消化活力有一定的组织特异性，但由于任一组织器官均不是由单一的组织细胞成分构成，所以，酶消化液常需根据所分离培养细胞的种类等因素进行筛选。如前所述，不同文献报道中对肺组织的消化选择了不同的酶消化液，但当前对各种酶消化液对肺MVECs分离培养效果的影响尚没有系统的研究报道。为深入了解不同酶消化液对肺组织的消化效果，筛选更适合于体外分离培养肺MVECs的酶消化液，本试验根据各种酶的功能特点和相关文献报道，选择胰蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、分散酶II和胶原酶II，分为单一酶消化液或两种酶的混合消化液共9组，研究分析其对大乳鼠肺组织的消化效果，及消化分离的细胞在接种培养后的贴壁生长情况，研究结果将为大乳鼠肺MVECs分离培养方法的优化和改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

倒置荧光数码显微镜(Olympus，IX71型)，CO2培养箱(Sanyo， MCO-17AC型)，超纯水仪(Millipore，Milli-QA10型)，无菌滤器(Millipore，货号SLGP033RB)，细胞培养板(Corning公司，货号3516)，等。

1.2 主要试剂与溶液

胎牛血清(Gibco，货号10099-141)，DMEM(Gibco，货号11995-065)，D-Hank’s(Sigma，货号H2387)，木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，货号G8430)，弹性蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，39445-21-1)，胰蛋白酶(Amresco，货号F746-2)，分散酶II(Worthington，货号LS02100)，胶原酶II(Worthington，货号4176)，等。

木瓜蛋白酶溶液：用含5mM L-半胱氨酸的生理盐水配制，浓度0.1%；胰蛋白酶溶液：用D-Hank’s液配制，浓度0.25%；弹性蛋白酶溶液、分散酶II溶液和胶原酶II溶液：均用DMEM配制，浓度均是0.1%；木瓜蛋白酶-胰蛋白酶溶液：用含5mM L-半胱氨酸的生理盐水配制，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶浓度均为0.1%；胰蛋白酶-弹性蛋白酶溶液：用DMEM配制，胰蛋白酶和弹性蛋白酶浓度均为0.1%；分散酶II-胶原酶II溶液：用DMEM配制，分散酶II和胶原酶II浓度均为0.1%；弹性蛋白酶-胶原酶II组：用DMEM配制，弹性蛋白酶和胶原酶II浓度均为0.1%。

1.3 大鼠肺组织的消化与原代培养

新生SD大鼠5只(购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂)，酒精擦拭消毒，断颈处死，无菌打开胸腔，取出肺脏，参照相关文献[7]，按照下述步骤进行处理。置于预冷D-Hank’s液洗去血污，剪取肺脏边缘组织，除去脏膜和大的气管、血管组织，剪成约1 mm3大小的组织块，随机分为木瓜蛋白酶组、胰蛋白酶组、弹性蛋白酶组、分散酶II组、胶原酶II型组、木瓜蛋白酶-胰蛋白酶组、胰蛋白酶-弹性蛋白酶组、分散酶II-胶原酶II组和弹性蛋白酶-胶原酶II组，共9组，各组置于离心管，分别加入组织量5倍体积的相应消化酶溶液，于37 ℃水浴锅消化。

在肺组织消化后第15 min、30 min和60 min时分别对各组观察、拍照，并将各组离心管的肺组织消化物用移液器吹打数次，使其充分混合和分散。各组消化60 min后，过70 μm细胞筛，收集滤液离心，将沉淀用含20% 血清的DMEM完全培养基重悬，接种于细胞培养板，于含5% CO2的37 ℃细胞培养箱静置孵育2 h后，洗去未贴壁细胞培养物，对各组观察、拍照。

2 结 果

2.1 不同消化液对大乳鼠肺组织的消化结果比较

不同消化液对大乳鼠肺组织的消化结果显示，消化15 min时，各组肺组织的整体状态均无明显变化，除木瓜蛋白酶组的肺组织边缘仍较锐利外，其余各组的肺组织块边缘部分均略有蓬松，只有少量的脱落单细胞或小细胞团。消化30 min时，木瓜蛋白酶组肺组织块仅边缘部位呈毛糙模糊状态；其他各组的肺组织均呈现不同程度的松散状态，组织块的透光性增加，移液器吹打后大多失去完整的块状结构。其中，胰蛋白酶组、胰蛋白酶-弹性蛋白酶、弹性蛋白酶-胶原酶II组和分散酶II-胶原酶II组的肺组织蓬松程度和脱落的细胞量较其他4组更大，吹打后呈黏液团状。消化60 min时，木瓜蛋白酶组的肺组织块多呈松散状，透光性增加，但大部分肺组织仍为团块状，移液器吹打后不散开；其他各组用移液器吹打后均较好地分散，无较大的块状结构。显微镜观察结果显示，胰蛋白酶组、胰蛋白酶-弹性蛋白酶组和弹性蛋白酶-胶原酶II组的肺组织消化最为充分，细胞团块最少，其他5组无明显差别(图1)。

A.木瓜蛋白酶组，B.弹性蛋白酶组，C.分散酶II组，D.胰蛋白酶组，E.胶原酶II型组，F.木瓜蛋白酶-弹性蛋白酶组，G.胰蛋白酶-弹性蛋白酶，H.弹性蛋白酶-胶原酶II组，I.分散酶II-胶原酶II组；标尺=500 μm图1 不同酶溶液消化大乳鼠肺组织60 min时的显微照片 A. Papain, B. Elastase, C. Dispase II, D. Trypsin, E. Collagenase II, F. Papain-elastase, G. Trypsin-elastase, H. Elastase-collagenase II, I. Dispase II-collagenase II; Bar=500 μmFig.1 Microphotographs of suckling rat lung tissue digested by enzyme solutions for 60 minutes

2.2 大乳鼠肺组织不同酶消化物的细胞贴壁结果

为进一步了解不同消化液对细胞活力的影响，对各组肺组织消化分离的细胞进行了接种培养。结果显示，木瓜蛋白酶组无明显贴壁细胞，分散酶II-胶原酶II组的贴壁细胞数最多，其次为胰蛋白酶组、胶原酶II型组和弹性蛋白酶-胶原酶II组，弹性蛋白酶组、分散酶II组和木瓜蛋白酶-弹性蛋白酶组仅有少量的细胞贴壁；胰蛋白酶-弹性蛋白酶组的单细胞量虽然在各组中较大，但贴壁细胞的量显著少于除木瓜蛋白酶组外的其他各组(图2)。

3 讨 论

为了筛选消化法分离培养大乳鼠肺MVECs的组织消化液，本试验选择了5种消化酶，分别配制成单一酶消化液或混合酶消化液共9种。其中，0.1%木瓜蛋白酶溶液对大乳鼠肺组织消化能力最弱，60 min时仅有少量的单细胞解离，且几乎无细胞贴壁生长，这与文献报道其主要应用于神经组织的细胞分离相符[8]，鲜见用于肺组织的消化；0.25%胰蛋白酶溶液的消化力虽强于0.1%弹性蛋白酶溶液、0.1%分散酶II溶液和0.1%胶原酶II溶液，且胰蛋白酶溶液与弹性蛋白酶溶液联合应用时，对肺组织的消化能力强于本试验所用其他各种消化液，但使用此两种消化液获得的贴壁细胞量却显著少于分散酶II-胶原酶II溶液和分散酶II溶液，其原因可能在于，胰蛋白酶的消化作用强烈，在组织或细胞消化过程中易造成细胞损伤[9,10]，甚至造成细胞的溶解，降低了肺MVECs的活力。

A.木瓜蛋白酶组，B.弹性蛋白酶组，C.分散酶II组，D.胰蛋白酶组，E.胶原酶II型组，F.木瓜蛋白酶-弹性蛋白酶组，G.胰蛋白酶-弹性蛋白酶，H.弹性蛋白酶-胶原酶II组，I.分散酶II-胶原酶II组；标尺=200 μm图2 不同酶溶液消化的大乳鼠肺组织微血管内皮细胞培养物 A. Papain, B. Elastase, C.Dispase II, D. Trypsin, E. Collagenase II, F. Papain-elastase, G. Trypsin-elastase, H. Elastase-collagenase II, I. Dispase II-collagenase II;Bar=200 μmFig.2 Microvascular endothelial cell cultures from suckling rat lung tissue digested by enzyme solutions

本试验选用的5种消化酶中，分散酶II和胶原酶II的活性需要Ca2+的存在[11,12]，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性需要EDTA的存在[13,14]，而弹性蛋白酶一般不需要活化剂[15]；木瓜蛋白酶活性的维持需要弱酸环境[13]，胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胶原酶II一般在弱碱性条件下活性较高[12,14]，而分散酶II则在弱酸和弱碱性条件均有良好活性[11]。鉴于此，为了更好地发挥酶的活性及避免不同酶的互相干扰，本试验选择了木瓜蛋白酶-弹性蛋白酶、胰蛋白酶-弹性蛋白酶、弹性蛋白酶-胶原酶II、分散酶II-胶原酶II的混合溶液；其他任何两种或多种酶类溶液联合应用时，例如胰蛋白酶和胶原酶II，则需要将两种溶液分别使用，并在两次消化步骤间进行离心，以去除残留的前一酶溶液对后续酶消化的影响。

肺组织中的细胞种类主要有上皮细胞、成纤维细胞、MVECs和巨噬细胞等，上皮细胞等贴壁所需时间一般较成纤维细胞和MVECs长，所以差速贴壁是纯化肺MVECs的常用方法[16]，本试验根据前期实践经验，在接种培养后2 h除去未贴壁细胞，结果表明，在选择合适的消化酶时，该时间点可有足够数量的细胞贴壁。

本试验通过使用9种不同消化液处理大乳鼠的肺组织，比较分析其消化状态和消化物接种培养的贴壁细胞量，结果表明，分散酶II-胶原酶II溶液是培养大乳鼠肺MVECs的最佳组织消化液，于37 ℃水浴消化60 min，能够将肺组织块充分地消化解离为单细胞状态，并使消化物保持良好的活性，接种培养2 h后可获得合适密度的贴壁细胞。