中药防风抗流感病毒活性及不同极性部位的谱效相关性分析

姜晓琳，张继秋，徐瑞蕊，蒋明浩，亢倩丽，杨 勇，巩丽丽*

1山东中医药大学药学院；2山东中医药大学实验中心，济南 250355

防风为伞形科植物防风(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)未抽花茎的干燥根。味辛、甘，微温，归膀胱、肝、脾经，有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效[1,2]。防风的化学成分主要包括色原酮类、香豆素类、有机酸、多糖类等[3,4]。Yao等[5]通过研究白芷、防风、紫苏叶单味药材及配伍体外对呼吸道核胞病毒的影响，结果证明防风具有抗呼吸道核胞病毒的活性，且与紫苏配伍后效果显著，但是关于其单一味药抗病毒活性的药效成分及作用机制尚未见报道。因此本实验欲采用CPE法证实防风单味药的抗流感病毒活性及其抗流感病毒活性成分。近年来指纹图谱技术用于中药研究非常广泛，能够对中药复杂的化学成分进行表征，但是无法体现与药效的关联性。中药谱效关系学是将指纹图谱与其药效作用结合起来，不仅可以使指纹图谱中化学成分体现出相应的药效，而且还能阐明指纹图谱特征与药效的相互关系，确定相应的药效物质基础，从而使构建的药效指纹图谱更有针对性的控制中药质量[6]。高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)采用高效液相色谱对复杂混合物进行快速分离，结合高性能四级杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数Orbitrap检测技术实现对复杂样品的定性和定量分析，具有灵敏度高、准确度高、检测效率高等特点[7]。本实验建立防风不同极性部位LC-MS指纹图谱，比较不同极性部位的抗流感病毒活性，采用Spearman分析、灰色关联度分析及最小偏二乘回归分析三种方法分析防风不同极性部位与抗流感病毒活性的谱效关系，根据秩相关系数、关联度及VIP值共同推断出主要药效成分，为防风抗流感病毒药效的物质基础研究提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

EYELAN-1100旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社)；XMTD-204恒温水浴锅(天津赛得利斯实验分析仪器制造厂)；1/10万电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；Centrifuge 5418离心机(Eppendorf公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UltiMate 3000超高效液相色谱仪(美国Thermo公司)；UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS(美国Thermo公司)；SD-CJ-ID生物安全柜(苏州净化设备厂)；HF90 CO2恒温培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；CKX-31倒置显微镜(olympus公司)；TC20细胞计数仪(Bio-Rad公司)；移液枪(Eppendorf公司)。

1.2 材料

防风(批号2019.03.22)，经由山东中医药大学中药鉴定教研室徐凌川教授鉴定为伞形科防风属植物防风(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)的干燥根。环己烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；二氯甲烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；正丁醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；甲醇(G，R，天津市四友精细化学品有限公司)；利巴韦林注射液(Rebavinrin injection，山东鲁抗辰欣药业股份有限公司，批号1612246411，浓度50 mg/mL)；酪氨酸(批号140609-200610，纯度：99.57%)、咖啡酸(批号110885-201703，纯度99.65%)、7-羟基香豆素(批号111739-200501，纯度99.48%)，均购于上海恒远生物科技有限公司；娃哈哈纯净水、蒸馏水；DMSO溶液(1427C108)；DMEM培养基(Gibio公司)；PBS缓冲溶液(Gibio公司)；胰酶(Gibio公司)；新生牛血清(ABW)；青霉素和链霉素(Hyclone)；MDCK细胞(由山东省医学科学院基础医学研究所微生物室提供，本科室保存)；H1N1病毒(2000年10月引自中国预防医学科学院病毒所毒种室)。

2 实验方法

2.1 防风不同极性部位的制备

称取200 g防风药材，粉碎，过2和4号筛，得粗粉。加十倍量甲醇，超声提取30 min，重复两次，合并滤液，抽滤，得到滤液。减压回收溶剂，得到浸膏。加入适量的蒸馏水，制成混悬液，然后依次用等量的环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水各萃取两次，得到各部位的萃取液。减压回收各部位溶剂，得到各极性部位浸膏和粉末。

2.2 防风不同极性部位的抗病毒活性

2.2.1 防风不同极性部位供试品溶液的制备

称取防风各极性部位浸膏适量，用DMEM培养基溶解，配成50 mg/mL的溶液。

2.2.2 病毒毒力的测定

将处于对数生长期的MDCK细胞用0.25%的胰酶消化，调整细胞浓度至1×104个/mL，每孔100 μL接种至96孔板，恒温培养箱内培养长至单层，弃掉培养液。依次加入10倍系列稀释的H1N1病毒液100 μL，每个浓度重复四孔，同时设置细胞对照。在37 ℃，5% CO2条件下恒温培养箱内培养24 h，各孔分别加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，培养4 h，吸弃染液，加入DMSO溶液100 μL，室温下脱色10 min，震荡6 min，酶标仪测490 nm下的OD值，根据Reed-Muench公式计算病毒的半数感染浓度TCID50。

细胞存活率=各组OD值/正常细胞OD值×

100%

细胞比距=(高于50%病变率-50%)/

(高于50%病变率-低于50%病率)×100%

TCID50= Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀释度+比距×稀释因子对数)

2.2.3 药物对细胞的毒性作用

按照2.2.1中方法将防风各极性部位药物用DMEM培养基按2倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于MDCK细胞已经长成单层的96孔板中，每个浓度重复3孔，同时设置正常细胞对照组，37 ℃，5% CO2条件下恒温培养箱内培养24 h，倒置显微镜下观察细胞病变程度，用MTT染色，用酶标仪在490 nm下测定OD值，根据Reed-Muench公式计算细胞半数中毒浓度TC50，找到最大无毒浓度TC0。

2.2.4 药物体外抗病毒实验方法

将1×104个/mL处于对数生长期的MDCK细胞接种于96孔板上，每孔100 μL，待细胞长成单层后，吸弃培养液，将药物从最大无毒浓度开始，按二倍比系列稀释共12个浓度，设细胞对照、病毒对照、利巴韦林为阳性对照(10 mg/mL),每个浓度重复3孔，除细胞对照外，各孔加入50 μL含100个TCID50的病毒液，混合均匀。37 ℃，5% CO2条件下培养箱中培养，观察病毒对照组病变情况，待细胞出现90%及以上病变时采用CPE法记录各组药物抑毒情况，用MTT法测量OD值，根据Reed-Muench公式计算防风各极性部位的半数有效浓度(EC50)及治疗指数(TI)，C为供试品初始浓度。

EC50= [Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀释度的值-比距)]×C

治疗指数(TI)= 半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)

2.3 防风不同极性部位LC-MS指纹图谱的建立

2.3.1 防风不同极性部位供试品溶液的制备

称取防风甲醇总提物及相当于生药量1 g的环己烷部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和萃取后水部位浸膏，用70%甲醇溶解，配成浓度分别为11.52、3.75、0.63、5.97、150.75 mg/mL的供试品溶液。

2.3.2 LC-MS液质条件

Halo-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，流动相0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱(0～4 min，5% B；4～8 min，5%→15% B；8～23 min，15%→75% B；23～28 min，75%→100% B；28～30 min，100% B)，柱温30℃，进样量3 μL，体积流量0.3 mL/min。源内温度320 ℃，辅助气温度350 ℃，S-lenS RF水平55%，分辨率70 000，质谱扫描范围m/z80～1 200。

2.3.3 精密度试验

取防风甲醇总提物样品制备供试品溶液1份，连续进样6次，记录色谱图，以7号峰为参照物峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取防风甲醇总提物样品制备供试品溶液6份，分别进样，记录色谱图，以7号峰为参照物峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3%，表明实验重复性良好。

2.3.5 稳定性试验

取防风甲醇总提物样品制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图，以7号峰为参照物峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 数据分析

本实验数据的Spearman分析、灰色关联度分析及偏最小二乘回归分析采用Excel 2016、Simca-p 19.0软件处理。

3 结果与分析

3.1 抗流感病毒实验结果

根据文献[8]，一般认为TI值≥2.00，证明药物有抗病毒活性，TI值≥4.00，其抗病毒成分有研究价值。本实验研究结果表明，防风不同极性部位药物对H1N1流感病毒均有不同程度的抑制作用，其中水部位药物抗H1N1流感病毒活性最高，其TI值为54.32，甲醇总提物部位药物抗H1N1流感病毒活性次之，其TI值为48.76，其他部位的抗H1N1流感病毒活性相对较弱，见表1

3.2 数理统计与显著性检验

本文表格中TC50、EC50由CPE观察得到。采用SPSS 19.0软件分析上述数据。选择单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P= 0.05为显著性水准，分析结果见图1。与阳性对照药利巴韦林(EC50为7.843 6 μg/mL，TI为36.25)比较，甲醇总提物与萃取水部位差异显著(P< 0.05)，抗流感病毒活性较强。

3.3 样品中成分的鉴定

取“2.3.1”的供试品溶液，按照“2.3.2”的色谱条件进行分析，得到防风不同极性部位指纹图谱，见图2。使用Xcalibur 3.0软件(Thermo公司，美国)对高分辨质谱信息进行数据分析，并结合相关文献及对照品的比对进行峰的指认，最终确定了28个色谱峰所对应的化合物，结果见表2。

表1 防风不同极性部位抗H1N1病毒活性的检测结果

图1 防风不同极性部位抗流感病毒TI值比较(t检验)Fig.1 Comparison of TI anti-influenza virus values in different polar parts of S.divaricata (t test)注：与S7比较：*P < 0.05。Note:Compared with S7,*P < 0.05.

3.4 防风不同极性部位抗流感病毒活性的谱效相关性分析

3.4.1 防风不同极性部位总离子流图分析

参考文献及对照品，对照甲醇总提物色谱峰，环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位分别鉴定出16、21、15、15、13个化合物，如表3。

3.4.2 Spearman分析

Spearman分析不仅能发现线性关系，也能发现单调的非线性关系；对分析的变量数据不需要正态性假设，还可以适用于等级数据(无法定量的顺序数据)；对异常数值敏感度低，因此，Spearman相关方法适用性更广[17]。

图2 防风不同极性部位在正离子模式下的UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS提取总离子流图Fig.2 The extract ion chromatogram of in positive ion mode from S.divaricata different polar parts using UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS注：A：甲醇提取总部位；B：环己烷部位；C：二氯甲烷部位；D：乙酸乙酯部位；E：正丁醇部位；F：萃取后水部位。Note:A:Total part of methanol extraction;B:Cyclohexane part;C:Dichloromethane part;D.Ethyl acetate part;E:n-Butanol part;F:Water part after extraction.

表2 防风不同极性部位的LC-MS数据

续表2(Continued Tab.2)

No.tR(min)分子式Formula准分子离子[M+H]+(m/z)测量值Calculated value质谱数据Mass data(m/z)化学成分Compound2420.50C12H8O5233.044 4233.043 7174.045 5、218.021 7、235.063 45-羟基-8-甲氧基补骨脂素[9]2520.51C19H20O5329.138 4329.138 283.049 7、229.084 8、247.095 3紫花前胡素[9]2620.54C17H16O5301.107 1301.107 169.071 0、218.021 2、233.044 6珊瑚菜素[9]2721.44C19H22O6347.148 9347.147 8217.048 0、259.094 03'-O-2-丁酰亥茅酚[10-13]2822.38C20H22O6359.148 9359.148 7200.236 5、279.158 73'-O-当归酰亥茅酚[10-13]

注：*根据对照品确定的物质。

Note：*Substance identified by reference.

表3 防风不同极性部位化合物峰强度

注：相应保留时间下未检测到的峰强度为“1”。

Note：The peak intensity not detected at the corresponding retention time is "1".

本实验将防风不同极性部位化合物峰强度与抗流感病毒活性进行相关性分析(P<0.05)，参考文献[18]，计算Spearman秩相关系数(rs)，如表4，|rs|≥0.8表示高度相关，0.5≤|rs|<0.8表示中度相关，0.3≤|rs|<0.5表示低度相关，|rs|<0.3表示不相关，rs为正表示正相关。本实验按照以上参数为标准，确定1、5、6、7、10、11、12、13、20、24号峰与药效作用相关。

表4 Spearman秩相关系数(rs)

3.4.3 灰色关联度分析[19]

本实验研究防风不同极性部位化合物峰强度对流感病毒的抑制作用，将治疗指数(TI)作为母序列，记为X0(k)；不同极性部位化合物峰强度作为子序列，记为X1(k)，X2(k)，…，X28(k)，n=1,2,…,6。采用归一化法对数据进行无量纲化处理，Xi(k)=Xi(k)/Xi[SUM(1～k)]，i=0,1,2,…,28。

(1)关联度系数计算

ξi(k)=(△min+ρ*△max)/(△i(k)+ρ*max)；△i(k)=∣Xi(k)-X0(k)∣

△min=min∣X0(1)～Xi(k)∣，△max=max∣X0(1)～Xi(k)∣

ρ为分辨系数，0 ≤ρ≤ 1，通常取ρ=0.5

将防风不同极性部位化合物峰强度与抗流感病毒活性进行灰色关联度分析，参考文献[19]，以γ≥0.75表示子序列对母序列有影响，计算关联度γ，如表5。确定1、3、5、7、8、9、11、12、13、20、22、23、24、25、26、28号峰对抗流感病毒活性有影响。

表5 灰色关联度(γ)

3.4.4 偏最小二乘回归(PLSR)法分析

偏最小二乘回归(PLSR)分析法是从应用领域中提出的一种新型多元数据分析方法。近十几年来，它在理论和应用方面都已得到迅速的发展。偏最小二乘回归分析主要适用于多因变量对多自变量的线性回归建模，并可以有效地解决许多用普通多元性回归无法解决的问题[20]。本实验以防风不同极性部位化合物峰强度为自变量，抗流感病毒活性为因变量，进行谱效相关性分析。

本实验利用SIMCA-P 19.0软件，采用PLSR分析法进行谱效相关性分析，计算得到28个特征峰与抗流感病毒活性的标准化回归系数(图2-A)和VIP值(图2-B)。VIP>1时，自变量在解释因变量时具有重要意义[21]。由图3可知，峰1、3、5、7、8、9、11、13、20、22、24、28的VIP值均大于1，且其回归系数均为正相关，故说明这12个峰对应的物质对于细胞抗流感病毒作用有重要影响。

4 讨论

本实验以防风为研究对象，采用CPE法对防风总提取物及不同极性部位进行了体外抗流感病毒活性研究。根据测定的TI值,抗流感病毒活性顺序为：水部位>甲醇总提物>正丁醇部位>环己烷部位>二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位。为探究防风中具体的抗流感病毒活性成分，本实验将防风抗流感病毒TI值与不同极性部位的共有峰峰强度进行谱效相关分析。采用Spearman简单相关对实验进行初步分析，而后运用灰色关联度分析，但灰色关联度分析对数据的要求较低，无法建立相应的数学模型。偏最小二乘回归分析法集多元线性回归、典型相关分析和主成分分析的基本功能于一体，可操作性高，建立的数学模型较为准确，确保模型较好的精度所需包含的成分数量，保证了模型的推广性[22]。综合上述分析方法的利弊，本实验联用Spearman分析、灰色关联度分析、偏最小二乘回归分析三种方法，可以更全面地分析防风不同极性部位与抗流感病毒活性的谱效关系，以保证分析结果的准确性。

本实验建立了防风不同极性部位的LC-MS指纹图谱，确定了28种化合物，将28种化合物对应的峰强度与抗流感病毒活性指标进行相关计算。由Spearman分析、灰色关联度分析、偏最小二乘回归分析方法共同得出1、5、7、11、13、20、24号峰对抗流感病毒活性有影响，即焦谷氨酸、divaricatacid、升麻苷、亥茅酚苷、补骨脂素、异嗪皮啶、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素。其中升麻苷、补骨脂素及5-羟基-8-甲氧基补骨脂素与文献报道中发现的升麻苷、补骨脂素类化合物[23,24]具有一定的抗流感病毒能力相一致，进一步论证了本实验的可靠性，由此可推测，秩相关系数、关联度、VIP值均高于升麻苷、补骨脂素的焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、异嗪皮啶同样具有抗流感病毒活性，后期可利用细胞病变效应(CPE)法对焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、异嗪皮啶四个单体成分的抗流感病毒活性进行测定，进一步确证其抗流感病毒活性。本实验为探究防风的抗流感病毒作用机制提供参考依据，为下一步深入研究防风抗流感病毒活性物质基础及化学结构提供初步方向。

图3 防风PLSR标准化回归系数图(A)和对药效的VIP贡献图(B)Fig.3 PLSR normalized regression coefficient graph (A) and contribution of characteristic peaks of S.divaricata to VIP (B)