刺芫荽总黄酮超声提取工艺及抗氧化活性研究

刘芯宇，周昱彤，赵婷，温道健，翟锐锐，姚瑰玮，艾朝辉

（海南医学院药学院，海南 海口 571199）

刺芫荽（Eryngium foetidum L）. 又称刺芹、洋芫荽、野芫荽、假芫荽、大叶芫荽、缅芫荽、阿佤芫荽等，为伞形科刺芹属多年生草本植物，目前在世界范围内主要分布于拉丁美洲、东南亚和非洲等地区[1]，在中国主要分布于海南、广东、广西、云南等热带或亚热带地区[2，3]。刺芫荽通常以全草入药，可用于治疗感冒寒咳、哮喘、胃气痛、产后出血、跌打损伤、肠炎腹泻、消化不良、胸痛、麻疹内陷、气管炎、急性传染性肝炎、蛇咬伤等症[4～7]。

黄酮类化合物对多种肿瘤具有预防、治疗或化疗增敏作用，还具有降血糖、降血脂、降压、镇痛和抗炎作用[8，9]。若将总黄酮含量较高的刺芫荽只作为香料佐料使用，无疑是一种资源的巨大浪费。林华铭等[6]用乙醇回流提取法对刺芫荽总黄酮提取工艺进行了研究，提取黄酮的时间为1.5 h，试验耗时比较长。超声波辅助法提取黄酮是利用超声波不断振荡提取液，破坏细胞和细胞膜结构，增强细胞内物质通过细胞膜的透过率，有利于提取物的释放，与其他提取方法相比具有省时、高效、杂质少等优点[10～15]。但截至目前，用超声波辅助法提取刺芫荽中总黄酮的研究尚未见报道。近年来黄酮清除自由基的抗氧化剂研究引起了人们的关注，黄酮类化合物一直是人们关注的天然抗氧化剂之一[16～21]。目前，尚未见到有关刺芫荽总黄酮提取物抗氧化活性研究的报道。

鉴于此，利用超声辅助法提取刺芫荽中的总黄酮，通过单因素试验筛选工艺因素的适宜水平，再利用正交试验对提取工艺条件进行优化；并通过分析对羟基自由基（·OH） 和DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼） 自由基的清除效果以及抗油脂过氧化能力，对刺芫荽总黄酮提取物的体外抗氧化活性进行评价，旨为合理开发刺芫荽资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材 刺芫荽：采摘于海南，经鉴定为刺芫荽全草，40 ℃烘干后粉碎至40～60 目，备用。玉米油、大豆油：购于超市。

1.1.2 仪器 粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；分析天平：瑞士METILER；752 型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DK-S26 水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；RE-52 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III） 循环水真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.1.3 试剂 芦丁对照品：中国药品生物制品检定所，纯度≥99%；Vc、氯仿、冰醋酸、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇、碘化钾、磷酸缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、DPPH 等：均为分析纯，广州化学试剂公司。

1.2 试验方法

1.2.1 刺芫荽总黄酮的提取工艺 取刺芫荽粉末，加入乙醇溶剂，控制超声波水浴温度和超声时间，进行总黄酮的提取。

1.2.2 刺芫荽总黄酮得率的测定

1.2.2.1 标准曲线制作。精密称取芦丁标准品32 mg，加入体积分数60%的乙醇溶解并定容至100 mL，配成0.32 mg/mL 的标准储备液，摇匀，备用。

分别取芦丁标准储备液0（空白）、1.00、2.00、3.00、4.00 和5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，制成浓度分 别 为0、0.012 8、0.025 6、0.038 4、0.051 2 和0.064 0 mg/mL 的芦丁标准溶液。加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液10 mL；用60%乙醇定容，摇匀，静置15 min。用分光光度计在波长510 nm 处测定吸光度。以溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2.2 总黄酮含量测定。精密称取刺芫荽粉末1.0 g，加入60%乙醇溶剂20 mL 浸泡过夜；在超声波水浴温度60 ℃条件下，超声提取20 min；将提取液过滤，并置于50 mL 容量瓶中，用乙醇溶剂定容至刻度。移取该溶液5 mL 于25 mL 容量瓶中，加入显色剂显色，用分光光度计在波长510 nm 处测定吸光度。根据溶液浓度—吸光度标准曲线，得到总黄酮含量。根据公式，计算刺芫荽中的总黄酮得率：

总黄酮得率（%） =刺芫荽黄酮含量∕刺芫荽重量×100%

1.2.3 刺芫荽总黄酮超声提取工艺条件的优化

1.2.3.1 单因素试验[10～15]。考察因素为乙醇浓度、提取时间、料液比（mL/g）、提取温度。改变其中1 个因素的水平，固定其他3 个因素水平，进行刺芫荽总黄酮的提取。分析单因素不同水平对刺芫荽总黄酮得率的影响，根据总黄酮得率筛选某个因素的适宜水平。每处理均3 次重复。

（1） 乙醇浓度对刺芫荽总黄酮得率的影响。准确称取5 份刺芫荽粉末，试验乙醇浓度设40%、50%、60%、70%、80%计5 个处理，固定因素为料液比1∶20、超声温度60 ℃、提取时间30 min。

（2） 提取温度对刺芫荽总黄酮得率的影响。准确称取5 份刺芫荽粉末，试验超声温度设40、50、60、70、80 ℃计5 个处理，固定因素为乙醇浓度60%、料液比1∶20、提取时间30 min。

（3） 料液比对刺芫荽总黄酮得率的影响。准确称取5 份刺芫荽粉末，试验料液比设1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶25、1∶30 计5 个处理，固定因素为乙醇浓度60%、超声温度60 ℃、提取时间30 min。

（4） 提取时间对刺芫荽总黄酮得率的影响。准确称取5 份刺芫荽粉末，试验提取时间设10、20、30、40、50 min 计5 个处理，固定因素为乙醇浓度60%、料液比1∶20、超声温度60 ℃。

1.2.3.2 正交试验。根据单因素试验结果，采用乙醇浓度（因素A）、料液比（因素B）、提取时间（因素C）、超声温度（因素D） 四因素三水平的正交试验设计进行刺芫荽总黄酮的提取，确定最佳提取工艺条件。选用优化后的工艺条件提取刺芫荽中的总黄酮，对提取工艺的稳定性进行验证。

1.2.4 刺芫荽总黄酮的抗氧化活性 分别测定刺芫荽总黄酮对·OH 和DPPH 自由基的清除率，以及对大豆油和玉米油的抗氧化活性。

1.2.4.1 对·OH 的清除率。参考孟良玉等[16]方法测定。将提取的黄酮用旋转仪蒸发成膏状，再用蒸馏水将其配成质量浓度分别为0.24、0.30、0.36、0.48、0.60、0.72 mg/mL 的黄酮溶液，并分别移取黄酮溶液2 mL 于容量瓶中。依次加入9 mmol/L 的FeSO4溶液和8.8 mmol/L 的H2O2各1 mL，混合均匀，室温下静置10 min；再加入9 mmol/L 的水杨酸2 mL，混合均匀，室温下静置30 min。用分光光度计在波长510 nm 处测定吸光度。用蒸馏水代替水杨酸作为空白对照，并测定吸光度。根据公式，计算·OH 的清除率：

E（·OH） （%） ＝［1-（A1-A2） /A0］×100%

式中，E（·OH） —羟基自由基的清除率（%）；A0—空白吸光度；A1—总黄酮提取物反应的吸光度；A2—水杨酸参加反应时总黄酮提取物的吸光度。

1.2.4.2 对DPPH 自由基的清除率。参考张晓璐等[17]方法测定。配制质量浓度为0.4 mg/mL 的刺芫荽总黄酮待测液；分别取待测液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL 比色管中，加入浓度0.04 mg/mL 的DPPH 溶液2 mL，再加95%乙醇至10 mL，混合均匀，室温下放置20 min；离心，取上清液，用分光光度计在波长517 nm 处测定吸光度（A1）。另分别取待测液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于比色管中，加入95%乙醇至10 mL，其他操作同上，测定吸光度（A2）；用0.04 mg/mL 的DPPH 溶液2 mL 与95%乙醇8 mL的混合液作为参比，其吸光度记为（A0）。用质量浓度为0.4 mg/mL 的Vc 溶液代替总黄酮进行上述试验，作为对照。根据公式，计算DPPH 自由基的清除率：

E（DPPH） =［1-（A1-A2） /A0］×100%

式中，E（DPPH） —总黄酮提取液对DPPH 自由基的清除率（%）；A0—DPPH 溶液＋95%乙醇反应后的吸光度；A1—DPPH 溶液+不同体积总黄酮提取液的吸光度；A2—95%乙醇+总黄酮提取液的吸光度。

1.2.4.3 对油脂的抗氧化活性。参考孟良玉等[16]方法测定。取250 mL 的烧杯6 只，分别加入大豆油100 g；另取250 mL 的烧杯6 只，分别加入玉米油100 g。试验设刺芫荽总黄酮加入量0、0.2、0.4、0.6、0.8 g 计5 个处理，以加入Vc 0.2 g 作为对照；将油样置于（65±1） ℃的烘箱中，每隔2 d 测定1 次过氧化值（POV，用过氧化物的毫克当量数表示）。每次取油样2～3 g，置250 mL 具塞锥形瓶中，加入三氯甲烷与冰乙酸的混合液30 mL，立即振摇使其溶解；加入饱和碘化钾溶液1 mL，盖上塞子摇匀，在黑暗处放置3 min；加入蒸馏水100 mL，摇匀，并立即用0.002 mol/L 硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色，再加入淀粉指示剂1 mL 继续滴至蓝色消失为终点。并取相同量的三氯甲烷-冰乙酸溶液以及碘化钾溶液和蒸馏水，按照同一方法做空白试验。根据公式，计算POV：

POV（meq/kg） =（V1－V2） N/W×1 000

式中，V1—试样用去硫化硫酸钠溶液的体积（mL）；V2—空白试验用去的硫代硫酸钠溶液体积（mL）；N—硫代硫酸钠溶液的当量浓度（mol/L）；W—试样质量（g）。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以吸光度（A）为纵坐标、浓度（C） 为横坐标绘制标准曲线（图1），得到回归方程为A=10.18C＋0.003 7，R2=0.999 6。表明在溶液浓度为0.012 8～0.064 0 mg/mL时，吸光度与浓度具有良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对刺芫荽总黄酮得率的影响 随着乙醇浓度的增大，刺芫荽总黄酮得率呈先增加后降低的趋势变化，其中乙醇浓度为60%时指标值最大，此时总黄酮得率为1.062%（图2）。因此，筛选适宜的乙醇浓度为60%。

2.1.2 提取温度对刺芫荽总黄酮得率的影响 随着提取温度的升高，刺芫荽总黄酮得率呈先增加后降低的趋势变化，其中提取温度为70 ℃时指标值最大，此时总黄酮得率为0.857 8%（图3）。因此，筛选适宜的提取温度为70 ℃。

2.1.3 料液比对刺芫荽总黄酮得率的影响 随着料液比的增大，刺芫荽总黄酮得率呈先增加后降低的趋势变化，其中料液比为1 ∶25 时指标值最大，此时总黄酮得率为0.988 0%（图4）。因此，筛选适宜的料液比为1∶25。

2.1.4 提取时间对刺芫荽总黄酮得率的影响 随着提取时间的延长，刺芫荽总黄酮得率呈先增加后降低的趋势变化，其中提取时间为40 min 时指标值最大，此时总黄酮得率为0.988 0%（图5）。因此，筛选适宜的提取时间为40 min。

2.3 正交试验优化

在单因素试验结果的基础上，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）进行四因素三水平的L934正交试验设计（表1）。RA＞RB＞RD＞RC（表2），表明4 个因素对刺芫荽总黄酮得率的影响顺序为乙醇浓度＞料液比＞提取温度＞提取时间。在试验因素的设计水平范围内，优化提取刺芫荽总黄酮的最佳条件为A1B2C3D3，即乙醇浓度50%、料液比1∶25、提取时间50 min、提取温度80 ℃。

表1 L934 正交试验设计的因素及其水平Table 1 The factors and levels of L934 orthogonal experimental design

表2 正交试验的刺芫荽总黄酮得率Table 2 The total flavonoids yield by orthogonal experiment

验证试验结果显示，选用优选化的工艺条件提取刺芫荽总黄酮平均得率为1.385%，RSD 为1.55%，高于其他条件下的总黄酮得率。表明利用正交试验优选出的A1B2C3D3超声条件参数可靠，具有一定的实用价值。

2.4 黄酮的体外抗氧化活性

2.4.1 对·OH 的清除率 黄酮和Vc 对·OH 的清除率均随溶液浓度的增大而递增，在浓度0.048～0.144 mg/mL范围内，黄酮对·OH 的清除率为13.99%～39.82%，与Vc 对·OH 的清除率（13.70%～43.21%） 基本相当（图6）。表明刺芫荽总黄酮对·OH 具有较好的清除能力。

2.4.2 对DPPH 自由基的清除率 黄酮和Vc 对DPPH自由基的清除率均随溶液浓度的增大而递增，在浓度0.048～0.144 mg/mL 范围内，黄酮对DPPH 自由基的清除率为55%～70%，低于Vc 对DPPH 自由基的清除率（83%～90%） （图7）。表明刺芫荽总黄酮对DPPH 自由基有一定的清除能力。

2.4.3 抗油脂氧化能力 玉米油和大豆油加入黄酮后，油脂的POV 均明显低于其未加入黄酮处理；但不同浓度黄酮的抗油脂氧化能力不同，在质量浓度0～0.8%范围内，黄酮的抗油脂氧化能力随着溶液浓度的增大而递增（图8 和9）。在质量浓度为0.2%条件下，Vc处理的抗油脂氧化能力明显高于黄酮处理。进一步分析刺芫荽总黄酮对不同油脂的氧化抑制作用发现，相同浓度条件下，其对玉米油与对大豆油的抗氧化能力大体相当。表明刺芫荽总黄酮可以明显抑制油脂氧化，在0.2%质量浓度下刺芫荽总黄酮的抗油脂氧化活性弱于Vc。

3 结论与讨论

采用超声辅助法提取刺芫荽中的总黄酮，通过单因素试验对提取工艺中的单因素水平进行了筛选；在单因素试验结果的基础上，采用四因素三水平的正交试验设计，对刺芫荽中总黄酮的提取工艺条件进行了优化。正交试验结果显示，乙醇浓度对刺芫荽总黄酮得率影响最大、超声时间影响力度最小，最佳提取条件为乙醇浓度50%、料液比1 ∶25、提取温度80 ℃、提取时间50 min，该条件下总黄酮得率为1.385%。在低的乙醇浓度范围内，随着乙醇浓度的增大，刺芫荽细胞发生溶胀现象，细胞中的黄酮类化合物溶出增加，刺芫荽总黄酮得率升高；当乙醇浓度继续增大，根据相似相溶的原理，高浓度的乙醇溶液会溶解细胞中的色素、脂溶性等物质，从而使得总黄酮得率降低[10～12]。因此，在提取黄酮生产中，应注意乙醇浓度的控制。

在本研究中还对刺芫荽总黄酮的体外抗氧化能力进行了研究。结果表明，刺芫荽总黄酮提取物对·OH和DPPH 自由基均具有较好的清除能力，也具有较好的抗油脂氧化能力，但对DPPH 自由基的清除能力和抗油脂氧化能力弱于Vc。分析原因可能是使用的刺芫荽总黄酮为粗提物，未经过分离纯化，含有较多杂质，进而影响了其抗氧化活性。这也为刺芫荽黄酮类化合物的进一步探索与开发利用提供了理论依据。