糠醛渣改良土壤增强苕子对盐碱土的适应性

张美娟，王 冰，黄升财，陈红娜，时俊美，夏关雪莹，屈琳俐，程宪国※

（1.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；2.沈阳农业大学土地与环境学院，沈阳110866；3.山西师范大学生命科学院，临汾 041000）

0 引 言

盐碱土在地球上分布广泛[1]。中国的盐渍化土壤总面积约为9 913万hm2，居世界第三位[2]。盐碱地虽能种植作物，但成活率不高，过度使用化肥将会加重盐碱化程度[3]。因此，如何通过低成本高效率的改良措施，充分挖掘利用盐碱地这一潜在土地资源仍是当前亟需解决的重大科学问题。

目前盐碱地治理主要通过化学物质、有机物料、水利以及植物修复等改良措施进行，虽然取得一定的改良效果，但是化学改良、水利灌排及高成本有机物投入都会在改良成本及对环境资源的伤害上产生负面影响[4-5]。因此，低成本的有机物料投入在改善土壤物理性质、减少蒸发及抑盐方面具有更可行又经济的作用效果。糠醛渣作为糠醛生产的副产品有机物料，主要是由玉米芯等高温酸催化制备糠醛余下的残留有机物组成，具有酸性特征，富含大量有机质以及植物生长所需的各种元素[6-7]，同时，糠醛渣中含有大量纤维素和木质素，是一种低成本、可大批量生产的土壤有机改良剂[8-9]。已有研究表明，施用糠醛渣后土壤中有机质、K＋和可溶性Na＋含量显著增加[10]，CO32-和HCO3-含量显著减少，促进盐害离子向下淋溶，并显著提高土壤微生物活性[11]，进而提高土壤质量。因此，为减少盐碱土改良成本降低化学投入带来的资源环境风险与压力，通过低成本有机物料改良盐碱土，并进行植物修复也许是改善和利用盐碱地的有效选择。研究表明，种植耐盐碱植物能可以改善土壤理化性状、提高有机质和总氮含量、增加土壤微生物的数量和改善群落结构,从而改善盐碱土壤[12]。光叶紫花苕子(Vicia Villosa Roth)（简称苕子）富含蛋白质，具有根瘤固氮作用，能肥地养地，可做绿肥在贫瘠土壤上生长发育[13-14]。种植苕子可明显降低盐碱土中可溶性盐分,同时可以改变可溶性盐分和盐离子层次分布及盐分离子组成,有效地防止土壤次生盐渍化[15]。利用苕子种植改良盐碱地不仅有利于盐碱地草产业开发,创造生态和经济价值,而且在次生盐碱地开发利用中具有广泛的农学意义[16]。尽管不同改良措施和改良剂应用研究很多，但糠醛渣改良条件下的植物适应性栽对盐碱土改良效果鲜见报道。本文通过盆栽模拟试验，研究添加不同用量的糠醛渣改良盐碱土对土壤理化特性、细菌群落及苕子生长的影响，明确糠醛渣改良盐碱土的适宜用量，旨在为糠醛渣在盐碱地合理使用以及植物适应性栽培提供科学的理论支持与技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤采自黑龙江省安达市 （46°27′0″～46°27′43.98″N，125°21′00″～125°21′22.50″E），土壤为碎块状结构，理化性状差，紧实、孔隙少，植物根系残留少。土壤表层有1 cm厚的盐结皮和盐霜。土壤采集后，通过0.85 mm筛子去除石块和植物残留物备用。糠醛渣由大连万疆公司供试，为黑褐色粉末。光叶紫花苕子，由湖北鑫大叶牧草种业有限公司购得。供试盐碱土壤及糠醛渣的基本理化性状见表1。

表1 供试土壤及糠醛渣理化性质Table 1 Physical and chemical properties of soil and furfural residue

1.2 试验设计

试验在中国农科院资源区划所温室进行。盆栽试验采用的花盆尺寸30 cm×20 cm（直径×高），土壤质量为2 kg。为确保糠醛渣的适宜用量，进行了预试验，设对照处理（不添加糠醛渣）、添加土壤质量分数的5%糠醛渣（100 g）处理、添加10%糠醛渣（200 g）处理及添加20%糠醛渣（400 g）处理，培养植物发现添加20%糠醛渣的处理由于糠醛渣含量高，自然发酵，植物无法生长。因此，按着土壤质量为基数，试验共设3个处理：不添糠醛渣的盐碱土处理（对照），添加5%糠醛渣（100 g），添加10%糠醛渣（200 g）；每个处理3次重复。土壤与糠醛渣混匀备用，将苕子种子催芽2 d后，随机选取出芽均匀的种子播种在处理盆内，每盆10颗，浇水后覆膜，出苗后揭膜正常管理，每2 d每盆浇水50 mL。并在温室条件下进行3个月的盆栽培养。

1.3 样品采集

在实验室采集3个月后的苕子叶片，冻在-80℃冰箱保存，用于测定生理指标。将种植土样混匀后取一部分保存在-80℃冰箱中，高通量测序分析使用，剩余风干样品测定土壤理化指标。

1.4 试验方法

1.4.1 土壤理化性质测定

土壤含盐量采用烘干残渣法[17]；土壤有机质利用丘林法-180℃油浴[17]；土壤全氮测定采用凯氏法[17]；土壤全磷采用钼锑抗比色法[17]；土壤全钾测定采用乙酸铵浸提法[17]；pH值由1:2.5水土比-pH计检测[17]。

1.4.2 细菌16S rRNA的提取、扩增及测序

取冷冻土壤样品0.25 g，用土壤DNA提取试剂盒(MOBIO，USA)提取总DNA，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，A260/A280在1.8～2.0之间。利用通用引物338F(5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3")及 806R(5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3")对细菌16S rRNA的V3-V4区域进行扩增。PCR 20μL反应体系为：2μL 的2.5 mM dNTPs，5×Fastpfu Buffer缓冲液4μL，5μM正向引物和反向引物各0.8μL，Fastpfu聚合酶0.4μL，DNA模板10 ng，用水将反应体系补至20μL。PCR反应程序是95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸45 s，27个循环，72℃终延伸10 min，4℃结束。通过1%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA，USA)进行纯Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina,San Diego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。构建文库步骤:1）连接“Y”字形接头；2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.4.3 苕子生理指标测定

苕子株高等用尺子测量获得，用称量法测定其生物量；苕子叶片超氧化物歧化酶活性用氮蓝四唑法测定，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，在560 nm处测得吸光值[18]；苕子叶片中叶绿素用丙酮法提取，用分光光度计在645和663 nm下测定[18]；苕子叶片中的脯氨酸用磺基水杨酸进行提取，在520 nm波长处比色[18]。

1.5 数据分析

用Excel 2016进行数据整理，采用SAS9.0软件进行Duncan多重比较(α=0.05)。使用的UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。

2 结果与分析

2.1 糠醛渣对土壤pH及含盐量的影响

试验结果表明添加糠醛渣后有效地降低了土壤的pH值。由表2可知，添加5%糠醛渣后土壤pH值由原来的10.43下降到9.12；添加10%糠醛渣处理土壤pH值下降到7.62，这主要由于糠醛渣是强酸性物质，其中大量的H+与土壤中OH-发生中和反应的结果。各处理的含盐量都有所降低，下降幅度为5%高于10%。由于添加10%糠醛渣中糠醛渣用量较5%增多，添加10%糠醛渣中的含盐量略高于5%。

土壤pH和含盐量的下降幅度并不与糠醛渣的施用量呈正比，可能是由于糠醛渣施入量过多引起土壤盐分过量累积，这可能与糠醛渣本身含有的盐分有关，具体原因有待进一步探究。

表2 添加糠醛渣后土壤pH及含盐量的变化Table 2 Change of soil pH value and salt contents after adding furfural residues

2.2 糠醛渣影响盐碱土土壤细菌群落组成

2.2.1 细菌丰富度和多样性分析

高通量测序分析表明，3个处理土壤样品得到了最终用于后续分析的优化序列488 076条，用于物种分类的OUT 2 572个，共有33个门，81个纲、219个目、407个科、740个属。将OUT在97%相似性水平下划分，Coverage指数均为0.99，这说明测序数据量基本合理，能够比较真实的反映这3组样品中绝大部分的微生物多样性信息。Coverage的数据表明处理样品中微生物群落恢复的测序深度足够，这与Wang等[19]的研究结果一致。由表3结果可知，各个处理Chao指数平均值在1 529.89～2 235.82之间，添加5%糠醛渣处理Chao指数最高为2 235.82，所含物种最多；各个处理Shannon指数平均值在4.89～6.22之间，添加5%糠醛渣处理的Shannon指数最高，表现出的微生物物种最为丰富，其次是对照处理。Simpson指数最低，微生物多样性最高，添加5%糠醛渣处理的微生物多样性最为丰富。说明种植苕子的高用量糠醛渣对细菌种群丰度具有抑制作用，而低用量处理对土壤细菌种群丰度及富集具有一定促进作用。在土壤养分循环过程中，土壤细菌占有十分重要地位，因此当土壤细菌的数量降低时会引起土壤微生物功能的失调，从而使土壤养分和肥力的降低[20-21]。糠醛渣处理盐碱土引起的土壤微生物群落组成的变化是由土壤理化特性改变所致，而不是糠醛渣本身的微生物群落影响，因为糠醛渣是经高温提取木醋液而得到的副产品，基本属于灭菌产品，微生物的存活机率很小，所以糠醛渣本身的微生物很难影响盐碱土微生物群落变化。

2.2.2 门水平群落结构变化

通常平均相对丰度超过10%的细菌门类为优势门类。本研究细菌群落β-多样性分析结果表明，施用不同用量糠醛渣土壤细菌群落结构存在显著差异。在3个处理中，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi)是优势菌门。与对照相比，种植苕子添加糠醛渣的处理某些细菌门类的相对丰度发生了变化，说明种植苕子的盐碱土中糠醛渣的施入影响了土壤中细菌门类的相对丰度。

表3 土壤细菌群落多样性和丰富性指数Table 3 Soil bacterial community enrichment and diversity index

不添加糠醛渣的对照、添加5%糠醛渣和10%糠醛渣3个处理中，变形菌门(Proteobacteria)是含量最丰富的门，相对丰度分别为33.04%、30.79%、23.91%，Ma等[22-23]研究表明变形菌门为盐碱环境下最为常见的菌门，这与该研究中的结果一致。其次是放线菌门(Actinobacteria)分别为12.08%、15.52%、24.80%，且存在显著性差异，厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度分别为12.12%、14.05%、8.10%，绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度分别为13.74%、10.69%、7.93%。只有添加5%糠醛渣处理展示出以芽单胞菌门(Gemmatimonadeces)为优势门类，平均相对丰度为10.72%，显著高于CK和T2，而且酸杆菌门(Acidobacteria)在添加5%糠醛渣处理中的相对丰度高达6.27%，酸杆菌门(Acidobacteria)显著增加。有研究表明酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度与土壤盐度呈显著负相关[24]。此外，以拟杆菌门(Bacteroidetes)优势门类的处理只有添加10%糠醛渣处理，平均相对丰度为13.23%，而在添加5%糠醛渣中相对丰度最少，拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度与土壤盐度呈显著正相关[25]，说明添加5%糠醛渣中的含盐量最少，这与表2中的结果相一致。纤维杆菌门（Fibrobacteres）和未命名菌门Patescibacteria在添加10%糠醛渣处理中的相对丰度最高为8.87%（图1）。本研究中还发现了未命名菌门Patescibacteria，这也是首次在盐碱土中发现。Patescibacteria是候选门叶中的一种细菌超级门，缺乏孤立的代表。Patescibacteria序列首先报告在地下水和缺氧水生环境的沉积物中[26-28]。但是，宏基因组学分析已经证实，这种细菌门类具有广泛的环境分布，包括大多数半水生栖息地，如炼油厂，淡水海滩，热液地点或高山永久冻土[29-30]。这可能与安达地区开采石油相关，其具体机理及微生物群落结构的变化原因尚需进一步研究。

图1 土壤细菌主要门水平相对丰度Fig.1 Relative abundance of dominant bacterial phylum in soil

2.3 不同糠醛渣添加量对苕子的影响

2.3.1 不同糠醛渣添加量影响苕子的生物量

植物耐盐碱最直接的体现通常用株高和生物积累量等指标来表示[31]。生物量记录表明糠醛渣的施用影响了苕子植株生长（见表4）。3个处理的苕子株高、地上鲜质量、地上干质量、地下鲜质量和地下干质量均有显著性差异（P＜0.05）。添加5%糠醛渣处理和10%糠醛渣处理种植的苕子株高分别增长了58.4%和38.6%，添加5%糠醛渣处理下生长状况较好。地上鲜质量、地上干质量、地下鲜质量和地下干重随着添加糠醛渣用量的增加而减少。这与张玉凤等[32-33]的研究结果相似。表明糠醛渣在一定程度上可以促进苕子的生长发育，过量则产生抑制作用。

图2 不同处理苕子表型差异Fig.2 Phenotypic differences of Vicia villosa Roth in different treatments

2.3.2 糠醛渣添加影响苕子生理特性

植物体的叶绿素、可溶性糖、脯氨酸、MDA等生理指标均反映了植物受逆境胁迫的程度[34]。图3a可知，添加5%糠醛渣处理和10%糠醛渣处理下的叶绿素含量分别增加了46.7%和30.7%。植物生长需要进行光合作用，而叶绿素是光合作用必不可少的部分。在逆境条件下,植物对胁迫的响应表现为叶绿素含量降低[35]，叶绿素含量与苕子的长势紧密相关。李杰[36]研究发现随盐胁迫浓度的增加,紫花苜蓿叶片的叶绿素含量呈先上升后下降的趋势。但本研究添加5%糠醛渣处理的苕子的叶绿素含量明显高于添加10%糠醛渣处理。说明添加糠醛渣干预了植物叶绿素代谢过程,有利于叶绿素含量的积累,从而增强光合作用，减轻了盐碱胁迫对叶绿体的伤害。说明糠醛渣施用能够促进苕子光合能力。

表4 不同处理苕子株高和生物量Table 4 Plant height andbiomass of Vicia Villosa Roth of different treatments

植物在代谢过程中利用可溶性糖和脯氨酸等有机渗透调节物质的积累、合成来调节植物体内细胞渗透势的平衡,缓解胁迫对植物造成的伤害。可溶性糖是很多植物在逆境条件下的渗透调节物质。结果表明，对照、添加5%糠醛渣处理和10%糠醛渣处理苕子的可溶性糖含量存在显著性差异（P＜0.05），其中，添加5%糠醛渣处理处理下可溶性糖含量最高（见图3b），说明添加5%糠醛渣处理苕子植株具有较好的耐盐碱性。图3c结果可知，添加5%糠醛渣处理叶片中的丙二醛（MDA）的含量减少了53.8%。而添加10%糠醛渣处理叶片中的丙二醛含量增加了43.3%。说明糠醛渣处理盐碱土可以减少苕子叶片中的丙二醛累积，减轻了对植物细胞膜的损害，缓解了对苕子叶片伤害。添加5%糠醛渣处理和10%糠醛渣处理的苕子脯氨酸含量分别增加了91.3%和67.4%，说明添加适量的糠醛渣处理盐碱土使得植物细胞积累了更多的脯氨酸，影响了渗透物质的平衡调节，保护细胞不受损害（图3d）。李学强等[37]研究发现，随着盐碱胁迫程度的增加和胁迫时间的延长,欧李叶片可溶性糖含量越高,脯氨酸含量增加也越多。本研究表明，苕子的可溶性糖和脯氨酸含量随盐碱胁迫的减轻呈先升高后降低的趋势，说明可溶性糖和脯氨酸交替积累发挥渗透调节作用,提高了苕子叶片的耐盐碱能力。

图3 不同处理下苕子生理代谢物变化Fig.3 Changes of physiological metabolites in Vicia villosa Roth in different treatments

2.3.3 糠醛渣处理影响苕子保护酶的活性

抗氧化酶类的活性通常被认为是植物耐盐碱性的重要参考指标。表5可知，糠醛渣施用增强了过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性、过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性。添加5%糠醛渣处理和10%糠醛渣处理致使苕子叶片POD活性分别增加了34%和15%，且添加5%糠醛渣处理与其他处理之间均存在显著差异，说明添加5%糠醛渣处理下苕子叶片POD活性最强。与对照相比，添加5%糠醛渣处理导致苕子叶片CAT活性提高了149%，而添加10%糠醛渣处理苕子叶片CAT活性提高了29.6%，同时添加5%糠醛渣处理和10%糠醛渣处理的苕子叶片中的SOD活性均得到提升。与对照相比，添加5%糠醛渣处理苕子叶片的SOD活性增加65%，10%糠醛渣处理SOD活性增加36%。结果表明，适量的糠醛渣有利于改善盐碱土种植下苕子叶片中的POD活性、CAT活性和SOD活性，增强代谢能力，防止叶片脂膜过度氧化，增强苕子体内活性氧清除力，提高苕子叶片的抗逆性。但糠醛渣添加量达到10%后,可能是抗氧化酶的过度应急,最终导致POD活性、CAT活性和SOD活性有下降趋势。

表5 不同处理下苕子抗氧化酶活性比较Table 5 Comparison of antioxidant enzyme activities of Viciavillosa Roth among different treatments

本研究通过施用糠醛渣处理盐碱土栽培苕子的温室模拟盆栽试验，尽管验证了糠醛渣在改良盐碱土及促进苕子适应性栽培具有促进效果，有较好的应用前景，但与田间生态环境存在差异。因此，在田间管理水平下如何通过糠醛渣适量应用改善盐碱土质量，为植物适应性栽培提供技术支持仍需有待进一步探讨。

3 结 论

施用糠醛渣有效地降低土壤pH和含盐量，改善了苕子栽培盐碱土土壤微生物的多样性，酸杆菌门增加，拟杆菌门减少，增加了苕子叶片抗氧化酶活性，缓解盐碱胁迫对苕子的伤害，促进光叶紫花苕子的生长发育。因此，糠醛渣添加量为5%时改良盐碱土的效果相对较优。糠醛渣科学合理地施用可以有效改善盐碱土土壤微生态环境，为牧草类紫花苕在盐碱土上适应性栽培提供了一个有价值的科学参考。