铜绿假单胞菌对消毒剂的敏感性试验

许佳敏 边海霞 周云锋/宁夏晓鸣农牧股份有限公司 750001

关键字：铜绿假单胞菌； 消毒剂；筛选

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa， Pa)，俗称绿脓杆菌，广泛存在于环境中，为一类条件性致病菌。绿脓杆菌常可从鸡群及养殖场中分离到，尤其当鸡群处于应激状态时，极易感染，且致死率在 1%～90%，所以合理选用消毒剂对其消灭和防控极为重要。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 样品孵化绒毛。

1.1.2 试剂安立消，由瑞普（天津）生物药业有限公司生产；安灭杀，由默沙东动物保健品有限公司生产；卫可，由英国安德国际有限公司生产；百胜，由英国 Evans 生产厂生产； 醛立洁、二氯异氰尿酸钠、三氯异氰尿酸钠由宁夏智弘生物有限公司生产。

1.1.3 培养基普通肉汤培养基、普通琼脂平皿由北京路桥生物有限公司生产；十六烷三甲基溴化铵琼脂由青岛高科园海博生物技术有限公司生产。

1.1.4 仪器生化培养箱由上海跃进医疗器械有限公司生产；立式双层智能精密性摇床由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；洁净工作台由苏州尚田洁净有限公司生产。

1.2方法

1.2.1 细菌分离及鉴定无菌取绒毛0.1g加入10mL生理盐水，充分混合，作为10-2样品，以 10 倍稀释进行10-3、10-4样品稀释，稀释后充分混匀，分别取10-2、10-3、10-4样品1mL，采用倾注法接种十六烷基三甲基溴化铵琼脂（铜绿假单胞菌鉴别培养基），置于37℃培养16～30h。挑取典型菌落，与LB肉汤培养基中37℃震荡培养至对数生长期。按照以上操作纯化3次，取菌液1mL，提取DNA，16S 通用引物，进行PCR，将所得产物进行送检测序。

1.2.2 配置菌株悬液选取已纯化3次的单菌落接种到LB肉汤中，37℃震荡培养至对数生长期，制备浓度为1.0×108CFU/mL的菌悬液。

1.2.3 菌液定量杀菌试验

1.2.3.1 消毒剂的稀释 根据各消毒剂推荐的浓度将其稀释2 倍、10 倍、100 倍。

1.2.3.2 试验步骤 取稀释好的各消毒剂 5mL，分别加0.1mL的铜绿假单胞菌，混匀，室温孵育10min，30min，分别取 0.2mL涂布于普通营养琼脂培养基上。放于37℃温箱中培养24h，观察计数。试验每组重复3次。同时，设立阴阳对照组，阴性对照不加培养菌液，阳性对照不加消毒剂。

表1 不同浓度消毒剂作用不同时间后细菌杀灭率

1.2.4 同一消毒剂不同浓度，消毒后不同时间内孵化铜绿假单胞菌的检测根据之前实验室测定数据确定消毒药浓度，喷洒或擦拭物体表面，在消毒前、消毒后采集棉拭子，测定铜绿假单胞菌含量，进一步评定消毒药浓度范围及消毒间隔。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果细菌经染色、培养特性，结合产色素特点初步鉴定为绿脓杆菌。16S 基因测序经过Blast分析对比后，与铜绿假单胞菌各菌株16sRNA序列同源性为99%以上。进一步验证分离的菌株为铜绿假单胞菌。

2.2 菌液定量杀菌试验结果（见表1）

从表1可以结果看出，铜绿假单胞菌对消毒剂敏感性顺序为：立消＝三氯异氰尿酸钠＞安灭杀＞百胜＞卫可＞醛立洁＞二氯异氰尿酸钠。

2.3 同一消毒剂不同浓度，消毒后不同时间内孵化铜绿假单胞菌的检测 使用已筛选消毒剂最高稀释度及次之稀释度喷洒、擦拭孵化场发现，安立消、三氯异氰尿酸钠、安灭杀、百胜对其杀灭效果更有效。这与实验室筛选浓度相符。

3 讨 论

有研究表明表面活性剂类具有杀菌和去污作用，对绿脓杆菌、真菌有效[1]。在本试验中表面活性剂类消毒剂对本场区绿脓杆菌杀灭效果最好。同样张媛等表明表面活性剂类消毒剂新洁尔灭对绿脓杆菌杀灭效果良好[2]。氯类、醛类消毒药三氯异氰尿酸钠、安灭杀对其杀灭效果也较好，但是因二氯异氰尿酸钠长期使用已耐药，效果不理想。这与邓晶荣等实验相符。邓晶荣等表明聚维酮碘、戊二醛、三氯异氰尿酸能够有效灭杀多耐药铜绿假单胞菌， 低浓度的聚维酮碘与三氯异氰尿酸能够在5min内有效灭杀该细菌，而低浓度的戊二醛比聚维酮碘、三氯异氰尿酸的5min灭杀细菌的效果要差[3]。百胜主要成分为碘、磷酸、硫酸对绿脓杆菌杀灭效果也较好。而醛立洁、卫可、二氯异氰尿酸钠消毒效果不理想。所以合理选择和正确使用化学消毒剂，确保消毒效果至关重要。