黄海希瓦氏菌胞外产物特性研究

吴秋仙，刘学伟

（1.盐城市亭湖区水产技术推广站，江苏 盐城 224001；2.江苏长寿集团南山饲料有限公司，江苏 盐城 224001）

革兰氏阴性菌的胞外产物是病原菌的主要保护性抗原，与细菌的致病性及免疫保护性密切相关[1-2]。胞外产物（ECP）是病原菌在生长与繁殖过程中不断向环境中释放出的代谢产物。这些代谢产物对于细菌吸收营养物质、吸附和入侵宿主机体、在宿主体内扩散、繁殖以及抵抗宿主免疫因子的免疫作用等具有极为重要的作用。而有些胞外产物可以直接破坏宿主机体的体质，引起宿主的发病甚至死亡，如胞外蛋白酶、溶血素、细胞毒素等，胞外产物成为决定病原菌毒力的重要因素之一。目前已发现副溶血弧菌[2]、嗜水气单胞菌[3]、迟缓爱德华氏菌[4]等多种水产动物病原菌的胞外产物具有明显的致病性。胞外酶具有多种酶活性，如明胶酶、酪蛋白酶、卵磷酯酶、脂肪酶、淀粉酶、几丁质酶等，对宿主产生不同的作用和影响。

宋亚雄等[5]通过感染试验，证实黄海希瓦氏菌AP629致仿刺参全部死亡。为探讨菌株AP629的致病因素，该文通过平板玻璃纸法提取黄海希瓦氏菌AP629的胞外产物，对其进行了特性分析，为揭示黄海希瓦氏菌胞外产物的生物学特性积累了基础资料，为进一步解析菌株AP629发病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

黄海希瓦氏菌（Shewanella smarflavi AP629）分离于大连地区患“化皮病”的仿刺参，由该实验室证实为病原菌，-80℃保存。黄海希瓦氏菌参考菌株（S.marisflavi）KCCM41822由韩国釜庆大学疾病预防实验室赠送。

1.2 胞外产物的制备

用平板玻璃纸法[1]制备ECPs。将黄海希瓦氏菌AP629接种于营养肉汤培养基，28℃，震荡培养（180 r/min）24 h，取0.2 mL液体培养物涂布于预先放置一层灭菌玻璃纸的营养琼脂平板上，28℃培养24 h。每平板用3 mL磷酸盐缓冲液（PBS，0.01M pH值7.2）洗下菌体，收集菌悬液，于4℃ 14 000 r/min，离心20 min，取上清液，经 0.45 μm 和 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌或加入庆大霉素（终浓度2 g/L）过夜除菌，离心除去残渣即为胞外产物提取液。平板涂布培养，证实无菌生长后，低温保存备用。

每次使用前用紫外吸收法[6]测定其蛋白质总量，测定公式为

ρ（蛋白质）（mg/mL）=（1.5×A280-0.75×A260）×稀释倍数。

1.3 胞外产物中蛋白相对分子量的测定

采用解离非连续缓冲系统垂直板电泳[7]将胞外产物与电泳样品缓冲液等体积混匀，煮沸5 min，冷却后加样，每孔加20 μL样品，并加点Marker（Sigma，SDS-6H）。采用Tris甘氨酸（Gly）电泳缓冲液，4℃条件电泳。丙烯酰胺浓度：分离胶10%（v/v），浓缩胶4.75%（v/v）。浓缩胶部分恒定电流为30 mA，分离胶部分恒定电流为60 mA。电泳结束后，凝胶经考马斯亮蓝（CBB）R250（Sigma）染色后用 EPSON PERFECTION 248 PHOTO扫描仪扫描图片，Gel-Pro Analyzer软件分析各分离蛋白的相对分子量。

1.4 ECPs中酶的测定

分别配制含量为2 g/L的淀粉、4 g/L酪蛋白、10 g/L脂肪（吐温-80）、25 g/L卵磷脂平板和营养肉汁明胶，于37℃下过夜，去除水分，将胞外产物的粗提液（30 μL）点样于预先贴在培养基表面的灭菌双层滤纸片上（纸片直径0.5 cm），25℃下放置48 h后观察结果。脂酶和卵磷脂酶的产生以纸片周围出现不透明晕圈为阳性；观察明胶酶的产生时，滴加酸性氯化汞，以纸片周围出现透明圈者为阳性；观察淀粉酶的产生时，滴加新配制的Lugol氏碘液，有无色透明圈出现者为阳性[6]。

1.5 ECPs中蛋白酶活力测定

采用《生化技术导论》中的福林试剂法[8]，在37℃下每分钟水解酪素产生1微克酪氨酸定为一个酶活力单位。按下式计算：

蛋白酶活力单位=（A/15）×F

式中：A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸微克数；F为酶液最终稀释倍数。

1.6 酶抑制剂试验

ECPs与一些化学试剂在37℃保温1 h后，检测酶活的变化。各种试剂所用浓度见表2。配制时PMSF用丙酮溶解，其他的用蒸馏水溶解。

1.7 ECPs对小白鼠的致病性

分别设置 3个组，1个 ECPs试验组、1个AP629试验组，1个对照组，每组8只小白鼠（昆明品系，4周龄雌性）。ECPs试验组腹腔注射0.05 mL ECPs/只，浓度为2.25 mg/mL；AP629试验组腹腔注射0.05 mL/只，浓度为108cells/mL；对照组注射相同剂量灭菌PBS（0.01 M，pH值 7.2）。观察和记录小白鼠的活动和死亡情况。

1.8 ECPs对仿刺参的致病性

感染用幼参取自大连湾海参养殖场，体质量1～3 g，体长2～5 cm，运回实验室后在塑料水槽中暂养7 d，每天换水1/3，养殖用水为沙滤海水，水温11～14℃、pH 值 8.2～8.3、盐度 31.8、溶氧 8.6±0.3 mg/m3，不间断充气。分别设置3个组，1个ECPs试验组、1个AP629试验组，1个对照组，每组10头仿刺参（体长3～4 cm）。ECPs试验组体腔注射 0.02 mL ECPs/头；AP629试验组体腔注射0.02 mL ECPs/头，浓度为108cells/mL；对照组注射相同剂量灭菌PBS（0.01M，pH值7.2）。记录仿刺参症状和存活情况。

2 结果与分析

2.1 ECPs中蛋白的相对分子量大小

黄海希瓦氏菌AP629和S.marisflaviKCCM41822 ECPs的SDS-PAGE图谱见图1。菌株AP629和S.marisflavi KCCM41822 ECPs SDS-PAGE图谱完全相同。分子量为 114 kDa、66 kDa、39kDa、36 kDa、79 kDa的蛋白条带是菌株AP629和S.marisflavi KCCM41822共有的。

2.2 ECPs的特性分析

黄海希瓦氏菌AP629作用温度为25℃时，其ECPs酶比活力为12.52活力单位/mg蛋白。对黄海希瓦氏菌AP629的ECPs进行酶活性检测，结果表明ECPs具有酪蛋白酶和淀粉酶活性；具有卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性，无明胶酶活性，见表1。

一些金属离子和化学试剂对病原菌ECPs的酶活的作用见表2。从表 2可看到，当EDTA、PMSF、SDS、MnCl2作用浓度分别为 10、5、5、5 mM 时，ECP酶活受到不同程度抑制；Ca2+和Mg2+则提高ECPs的酶活，可提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。

表1 病原菌胞外产物的酶活性

表2 化学试剂对病原菌ECPs活力的影响

2.3 ECPs对小白鼠及仿刺参的致病性

ECPs对小白鼠的致病性，见表3，在每只小白鼠腹腔注射黄海希瓦氏菌AP629的ECPs，试验20 d期间，小白鼠无任何症状出现；菌株AP629试验组小白鼠全部死亡；对照组没有出现死亡。

试验20 d期间，注射黄海希瓦氏菌AP629的的ECPs的仿刺参没有出现化皮、死亡；注射菌株AP629的仿刺参陆续化皮、死亡；对照组都没出现任何症状。

表3 病原菌ECPs对小白鼠的毒性试验结果

3 讨论

黄海希瓦氏菌是仿刺参的一种条件致病菌，该文对黄海希瓦氏菌AP629的胞外产物进行了特性分析。胞外产物（ECPs）是水产动物病原菌侵染机体的主要成分之一，具有多种酶活性，如蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶、明胶酶、磷酸酯酶等活性对病原菌的致病性具有重要作用[9-10]。该文研究结果，黄海希瓦氏菌AP629的ECPs具有酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性，无明胶酶活性。张志强等[11]从大菱鲆分离出的迟钝爱德华氏菌的ECPs具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、卵磷脂酶活性，推测酶活性可能溶解水产动物细胞，为迟钝爱德华氏菌提供有益的生长环境。Sakai和Ellis[12-13]研究，杀鲑气单胞菌感染虹鳟后，其ECPs中具有蛋白酶水解胶原蛋白活性，以及杀白细胞素能破坏吞噬细胞，从而引起水产动物发生病理变化。周琳等[14]从患内脏白点病的大黄鱼体内分离出变形假单胞菌，其ECPs具有卵磷脂酶活性、胃蛋白酶活性、半胱氨酸蛋白酶等酶活性，并证实与病原菌的毒性有密切关系。

细菌的胞外产物蛋白成分非常复杂，导致蛋白条带的分子量有很大差异。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝R-250染色分析表明，黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株ECPs蛋白条带分布在79.0～114.0 kDa。陈雅芳等[15]报道，养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌ECPs蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0～66.2 kDa，费辰杰等[16]报道，牙鲆致病菌ECPs蛋白条带主要集中在分子质量范围18.0-120.0 kDa。本研究中一些金属离子和化学试剂对菌株AP629的ECPs的酶活具有一定的影响，当 EDTA、PMSF、SDS、MnCl2作用浓度分别为 10、5、5、5 mM 时，ECP 酶活性受到不同程度抑制；Ca2+和Mg2+则提高ECPs的酶活性，可提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。左凤琴等[17]研究鱼源溶藻弧菌当添加了金属螯合剂50 mmoL/L EDTA和100 mmoL/L苯甲基磺酰氟能分别使ECPs的酶活性下降83.40%和51.32%；曹煜成等[18]研究Zn2+和Mg2+对地衣芽孢杆菌胞外产物酶活性有降低作用。

在本试验中，腹腔注射黄海希瓦氏菌AP629 ECPs的小白鼠，及体腔注射菌株AP629 ECPs的仿刺参，与对照组一样，没有出现任何症状，可见黄海希瓦氏菌AP629的ECPs不显示致病力。张朝霞等[19]研究了副溶血弧菌的胞外产物对中国对虾具有致病性；贺扬等[20]研究了气单胞菌感染斑点鮰48 h后，开始出现症状并死亡；张志强等[11]和张海月等[21]研究，健康斑马鱼注射迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌均死亡；De la Cruz等[22-24]众多国外学者用鳗弧菌胞外产物感染日本鳝鱼、虹鳟和小鼠后，导致动物肠道普遍发生出血性炎症反应，肌肉组织受到严重损伤，而后陆续死亡。大多数细菌的胞外产物均具有致病性，该文通过对黄海希瓦氏菌AP629的ECPs的研究表明，菌株AP629的ECPs的有无对菌株的致病力可能无影响，确切的致病因子还需进一步研究。