白藜芦醇对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞炎症反应的干预作用

高韵， 吴东， 陈子瑜， 陈翠芬， 吴斌

（广东医科大学附属医院，广东湛江 524001）

支气管哮喘（简称哮喘）是慢性炎症性气道疾病，是全球发病率和病死率上升最快的疾病之一[1]。目前，吸入糖皮质激素是治疗哮喘的主要方案，但效果尚不令人满意[2]。因此，寻求哮喘的治疗药物仍是基础和临床研究中的热点。中药虎杖性微寒、味微苦，归肝、胆、肺经，能利湿退黄、清热解毒、止咳化痰[3]，其在临床可治疗呼吸道感染、肺动脉高压等呼吸系统疾病[4]。白藜芦醇是虎杖的主要活性成分[5]，具有抗炎[6]、抗肿瘤[7]、抗衰老[8]等作用。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是哮喘发作的重要诱因之一，它能在气道上皮细胞、肺成纤维细胞、 中性粒细胞、血管内皮细胞中诱导一系列炎症介质的瀑布样连锁反应，导致支气管痉挛，血管通透性增加，诱发和加重哮喘反应[9]。本研究旨在观察白藜芦醇对TNF-α 诱导的人支气管上皮细胞炎症反应的干预作用，并探讨其可能的作用机制，以拓展中药提取物白藜芦醇的应用价值，也为临床应用白藜芦醇治疗哮喘奠定基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养人支气管上皮细胞株16-HBE获自中科院上海细胞库。以含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。

1. 2 药物、试剂与仪器白藜芦醇（批号:R5010100112K5216）、TNF-α（美国Sigma 公司）。细胞计数试剂盒8（CCK-8）（日本同仁化学研究所）；Perfect Real Time 染料法实时荧光定量试剂盒、逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）；引物购自上海生工生物工程有限公司；核转录因子κB 抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化核转录因子κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、核转录因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化核转录因子κB p65（p-NF-κB p65）等兔抗（美国CST 生物公司）。全波长酶标仪（美国Thermo Scientific 公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（瑞士Roche 公司）；蛋白免疫印迹（Western Blot）转印仪（美国Bio-Rad公司）；增强型化学发光反应试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.3 CCK-8法测定16-HBE细胞存活率将16-HBE细胞以5 × 106个/孔接种在96 孔板，以0、50、100、150、200 μmol/L 的 白 藜 芦 醇 分 别 处 理16-HBE细胞24 h。加入10 mL CCK-8 液37 ℃孵育1 h。应用酶标仪于450 nm波长处测量吸光度（OD，D）值。

1. 4 实时定量PCR 法检测16-HBE 细胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表达水平以0、0.5、5、10 ng/mL TNF-α[10]刺激16-HBE 细胞24 h，或以10 ng/mL TNF-α刺激16-HBE细胞3、6、18、24 h，采用实时荧光定量PCR 法检测16-HBE 细胞中MMP-9、IL-1β、IL-6 mRNA 表达水平。50、100、150 μmol/L 白藜芦醇作用于16-HBE 细胞1 h，再用TNF-α 刺激23 h 后，采用实时荧光定量PCR 法检测16-HBE 细胞中MMP-9、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平。操作步骤:裂解细胞提取总RNA， 经氯仿、异丙醇、乙醇洗涤处理后，应用分光光度计定量D（260 nm）与D（280 nm）。分别取1 μg 总RNA，通过逆转录一步法，获得cDNA 产物，进行PCR 反应。引物序列:IL-6 正义链，5’-CCTGAA CCTTCCAAAGATGGC-3’；IL-6 反义链，5’-TTC ACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’；扩展片段长度75 bp。MMP9 正 义 链，5’-TGCATAAGGACGACGTGAAT GGC-3’；MMP9 反义链，5’-CTGCGGTGTGGTGG TGGTTG-3’；扩展片段长度89 bp。IL-1β 正义链，5’-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3’；IL-1β 反义链，5’-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3’；扩展片段长度62 bp。热循环条件:95 ℃2 min，40 个95 ℃循环10 s，60 ℃循环30 s。用2-△△Ct相对定量方法分析检测结果，并以内参基因GAPDH 对检测结果进行归一化处理。

1. 5 Western Blot 法 检 测16-HBE 细 胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表达以50、100、150 μmol/L 白藜芦醇分别处理16-HBE 细 胞1 h，再 用TNF-α 刺 激23 h 后，采 用Western Blot法检测16-HBE细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表达水平。操作步骤:取样本蛋白定量40 μg 煮沸5 min，通过十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转至0.22 μm 聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。新鲜配制的含0.5%Tween20 的TBS 中加入50 g/L脱脂奶粉进行封闭， 室温封闭1 h。分别加入兔抗IκBα 抗体（1∶1 000）、兔抗p-IκBα 抗体（1∶1 000）、兔抗NF-κB p65 抗体（1∶1 000）、兔抗p-NF-κB p65 抗体（1∶1 000）、兔抗GAPDH 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。洗膜3 次，加1∶2 000稀释的生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h。用TBST 洗膜3 遍，上机扫描图像、拍照。使用Image J 1.43 软件对蛋白条带灰度进行定量，结果以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值（p）表示。

1. 6 统计方法采用GraphPad Prism 7 软件进行数据分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用Student t 检验法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 不同浓度白藜芦醇对16-HBE 细胞活力的影响图1 结果显示，与0 μmol/L 白藜芦醇组比较，50、100、150、200 μmol/L 白藜芦醇组细胞存活率无明显变化（P ＞0.05）。提示白藜芦醇在0 ～200 μmol/L剂量范围内没有导致细胞活力下降，该浓度范围可用于后续细胞研究。

2. 2 TNF-α 对16-HBE 细 胞 中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表达的影响图2结果显示:与0 ng/mL TNF-α 组比较，0.5、5、10 ng/mL TNF-α 刺激16-HBE 细胞24 h 后IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表达水平增高，且具有浓度依赖性，其中，10 ng/mL TNF-α 最为明显，差异有统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.001）；与作用3 h 组比较，10 ng/mL TNF-α刺激16-HBE 细胞6、18、24 h 后IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表达水平增高，且具有时间依赖性，其中，24 h 作用最为明显，差异有统计学意义（P ＜0.01或P ＜0.001）。

图1 不同浓度白藜芦醇对16-HBE细胞活力的影响(±s)Figure 1 The effects of different concentrations of resveratrol on vability of 16-HBE cells(±s)

2. 3 白藜芦醇对TNF-α 诱导的16-HBE 细胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表达的影响图3 结果显示:与TNF-α 诱导组比较，50、100、150 μmol/L 白藜芦醇组16-HBE 细胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表达水平均降低，差异有统计学意义（P ＜0.001），且呈剂量依赖性。

2. 4 白藜芦醇对TNF-α 诱导的16-HBE 细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达的影响图4 结果显示:与TNF-α 诱导组比较，50、100、150 μmol/L 白藜芦醇组TNF-α 诱导的16-HBE 细胞中p-IκBα 蛋白表达水平增高，且呈剂量依赖性，其中，100、150 μmol/L 白藜芦醇组差异有统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.001），而p-NF-κB p65 蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

3 讨论

目前，建议以吸入性糖皮质激素为基石的阶梯式规范治疗哮喘[11]，但其只能使78%的哮喘患者达到临床控制，而且需要长时间治疗，并伴有一系列副作用[12]。尽管多种药物联合使用但仍不能获得很好的疗效，严重影响了患者的生活质量，并带来极大的家庭和社会负担，因此，迫切需求开发更安全有效的治疗药物。

图2 TNF-α对16-HBE细胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表达的影响(±s)Figure 2 The effects of TNF-α on mRNA expression levels of IL-6，MMP-9，IL-1β in 16-HBE cells(±s)

图3 白藜芦醇对TNF-α诱导的16-HBE细胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表达的影响(±s)Figure 3 The effects of resveratrol on the mRNA expression levels of IL-6，MMP-9 and IL-1β in TNF-α-induced 16-HBE cells(±s)

图4 白藜芦醇对TNF-α诱导的16-HBE细胞中IκBα、NF-κB p65 磷酸化的影响(±s)Figure 4 The effects of resveratrol on phosphorylation of IκBα、NF-κB p65 in TNF-α-induced 16-HBE cells(±s)

哮喘是以气道炎症、气道重塑和气道高反应为主要特征的肺部慢性疾病。有调查指出91%哮喘主要是由小气道炎症引起的[13]。有研究表明，IL-6 能调节树突状细胞摄取过敏原、促进Th2/Th17 介导的气道炎症[14]。IL-1β 参与炎症小体活化，作为活动性过敏性疾病（如哮喘）的生物标志物[15]。MMP-9 由支气管上皮细胞、肺泡上皮和许多炎症细胞产生，能募集炎症细胞和产生炎性介质[16]。故IL-6、IL-1β、MMP-9等炎症相关因子在哮喘气道炎症中起着至关重要的作用。白藜芦醇是一种药效学多样的多酚类中药提取物，具有改善细胞代谢、抗炎等生物效应。本研究结果显示:TNF-α能刺激人支气管上皮细胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 过表达，24 h 时最为明显（P＜0.05）。而经过白藜芦醇干预后，TNF-α刺激的人支气管上皮细胞产生的IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表达降低（P＜0.05），表明白藜芦醇可抑制TNF-α 刺激的人支气管上皮细胞炎症反应。

已知NF-κB 蛋白信号传导途径在支气管哮喘发病机制中被激活，参与了炎症反应的调控，其活化需要IκB 激酶的解离以及NF-κB 的核移位等2 个条件[17]。白藜芦醇可通过调控NF-κB通路起到调节炎症的作用[18-19]。本研究结果显示，TNF-α可促进16-HBE 细胞中IκBα的降解和NF-κB的活化，而白藜芦醇可抑制TNF-α 诱导的16-HBE 细胞IκBα 的降解和NF-κB 的激活，表明白藜芦醇可能通过阻止NF-κB活化来减轻炎症反应。

综上所述，白藜芦醇可抑制TNF-α 诱导人支气管上皮细胞的炎症反应，其机制可能与抑制NFκB的激活有关。