通腑降浊方对便秘型肠易激综合征大鼠粪便菌群结构的影响

刘永， 谷诺诺

（石家庄市中医院东院区，河北石家庄 050051）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是结肠的一种功能性疾病，临床多见，常因患者的结肠蠕动、环形肌收缩、黏液分泌等功能出现紊乱而导致各种症状，与精神因素关联密切，以腹痛、腹胀等腹部不适及排便习惯、大便性状异常为临床表现，症状持续或间歇发作[1]。IBS 便秘型（IBS-C）是其亚型之一[2]。流行病学调查报告显示:我国IBS-C 发病率约占26.70%[3]，逐年增高，且症状顽固，严重影响患者生活质量，但研究较少，发病机制不明确，西医药治疗作用局限。导师杨倩教授基于文献研究及临床实践，发现中医辨治本病有标本兼治、减少复发等优势，结合“浊毒理论”，自拟通腑降浊方治疗本病，见效颇多，但机理未明，推广受限。多项研究发现，IBS的发病与肠道微生物有密切关系，肠道菌群是一个复杂而庞大的微生态系统，往往通过“微生物—脑—肠轴”而影响本病[4]，因此，我们以大鼠粪便菌群的变化为切入点，以IBS-C模型大鼠为研究对象，探讨肠道微生物的变化，进而明确通腑降浊方治疗本病的作用机制，开拓中药研究思路，并丰富临床治疗本病的理论和实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1. 1 实验动物6 周龄清洁级雄性健康SD 大鼠49 只，体质量（100 ± 20）g，购自河北医科大学动物实验中心，实验动物许可证号:SCXK（冀）2013-1-003，动物质量合格证号:1610300。

1.2 实验药物通腑降浊方免煎颗粒剂（柴胡9 g、枳实9 g、白芍12 g、槟榔6 g、黄连6 g、飞扬草10 g、八月札10 g、冬葵子6 g、茯苓12 g、火麻仁9 g、罗汉果10 g、干姜6 g、甘草6 g），由广东一方制药有限公司提供，按比例溶于蒸馏水配制成质量浓度为1.156、2.313、4.625 g/mL 的溶液。西沙必利片（规格:5 mg/片），西安杨森制药有限公司生产，国药准字H10960289，溶于蒸馏水配成0.9 g/L混悬液。乳果糖口服溶液（规格:667 g/L；批准文号:进口药品注册证号H20120387），由荷兰Abbott Biologicals B.V.公司生产，溶于蒸馏水配成416.875 g/L溶液。

1. 3 实验试剂与仪器苏木素—伊红染色液（天津市永大化学试剂开发中心）；VECTASTAIN ABC试剂（美国Vecteor 公司）； TruSeq PCR-Free DNA建库试剂盒（美国Illumina 公司）；GeneJET 胶回收试剂盒（美国Thermo Scientific 公司）；DNA 提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）。Illumina HiSeq2500 测序平台（美国Illumina 公司）；ABI Gene Amp9700 型PCR 仪（美 国Gene 公 司）；Sartorious 精密电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；灌胃针（北京广源达科技发展有限公司）；HMIAS-2000 显微图像分析系统（武汉同济医科大学）；8-F儿童型带气囊导尿管（南通三利医疗器械有限公司）。

1.4 动物分组与处理将大鼠按照随机数字表分为正常组，模型组，西沙必利组，益生元组，中药高、中、低剂量组，每组各7只，并将除正常组外统称为造模组。将造模组大鼠给予普通饲料喂养7 d 适应实验室环境后，采用冰水灌胃法建立IBS-C大鼠模型[5]，即每日8∶30给予大鼠0 ～4 ℃冰水混合物灌胃，共14 d。每日于灌胃前称取大鼠体质量，于灌胃后更换大鼠垫料，24 h后捡取大鼠粪便，称取粪便质量，记录粪便粒数，观察粪便硬度及形态。若见大鼠粪便质硬、形状变小、含水量减少，鼠性易激惹，可判断造模成功[6]。

造模成功后，根据公式[大鼠每日用药剂量=成人每日用药总量/一般成人体质量（60 kg）× 10×大鼠体质量][7]（正常成人每日口服中药颗粒剂量为111 g，每日口服西沙必利片15～30 mg，口服乳果糖口服溶液15 mL）换算各组灌胃给药剂量。正常组与模型组:给予等体积生理盐水灌胃，每日1 次；西沙必利组:给予西沙必利片0.9 g/L 混悬液，按剂量为3.6 mg·kg-1灌胃，每日1次；益生元组:予乳果糖口服药417 g/L 溶液，按剂量为1 667.5 mg·kg-1灌胃，每日1 次；中药高、中、低剂量组:将通腑降浊方颗粒剂溶于蒸馏水分别配成浓度为4.625、2.313、1.156 g/mL 的溶液，按剂量为18.500、9.250、4.625 g·kg-1灌胃，每日1次。

1. 5 观察指标与方法（1）观察大鼠精神、体质量、饮食、毛发、尿量、粪便含水量及粒数等一般状况，判断造模成功与否及治疗后疗效。粪便含水量=（湿粪质量- 干粪质量）/湿粪质量×100%。（2）末次灌胃禁食24 h 后，收集大鼠2 粒粪便（不低于0.5 g），置入液氮中保存，后移交于北京诺禾致源生物信息科技有限公司，应用16S rDNA 扩增子测序技术，采用高通量测序，通过提取粪便DNA、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR、HiSeq上机测序、操作分类单元（OTUs）聚类和物种分类，再对OTUs 进行丰度、多样性指数、聚类、统计等分析检测大鼠粪便微生物群落结构。（3）采取断头法处死大鼠，快速剖取结肠，用生理盐水冲洗，用体积分数10%中性甲醛溶液于瓶装容器中固定，依此用60%乙醇（体积分数，下同）、75%乙醇各60 min、80%乙醇18 h、90%乙醇4 h、95%乙醇1.5 h、无水乙醇1 h 脱水；二甲苯透明后常规石蜡包埋切片，制作2 μm 厚石蜡切片，80 ℃烤片30 min，常温保存备用。HE 染色观察结肠组织病理变化。

1.6 统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料正态分布且方差齐者以均数± 标准差(±s) 表示，偏态分布的资料常用中位数和四分位数间距表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用SNK 法，若不满足正态分布，采用非参数检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 大鼠一般状况正常组大鼠一般状况良好，粪便质软，色黄，如麦粒状。造模组大鼠情绪易激惹，毛发乱，饮食减少，粪便质硬，色白，量少，多呈小黄豆状，提示造模成功。给药后，各治疗组大鼠情绪较之前稳定，粪便质地变软，数量增多，进食及毛发光泽好转，提示各组药物治疗有效，且肉眼未见明显差别，各阶段均无大鼠死亡、腹泻现象。每日于灌胃前记录各组大鼠体质量，发现各组大鼠体质量于实验期间均平稳增长，且增长趋势基本一致，各组间无统计学差异（P ＞0.05）。

2.2 各组大鼠粪便含水量及粪便粒数比较造模结束后，各造模组大鼠粪便含水量及粪便粒数较正常组明显减少（P ＜0.05），各造模组之间粪便含水量及粪便粒数无明显差异（P ＞0.05），提示造模成功。各治疗组分别给予对应治疗后粪便含水量及粪便粒数较模型组均有所增加（P ＜0.05），但仍低于正常组（P ＜0.05）。各治疗组间比较:中药各剂量组间粪便含水量及粪便粒数无明显差异（P ＞0.05）；中药各组粪便含水量及粪便粒数与益生元组比较，差异亦无统计学意义（P ＞0.05），但与西沙必利组比较，粪便含水量及粪便粒数均明显增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠粪便含水量及粪便粒数比较Table 1 Comparison of fecal moisture content and faeces number in rats of the various groups (±s)

表1 各组大鼠粪便含水量及粪便粒数比较Table 1 Comparison of fecal moisture content and faeces number in rats of the various groups (±s)

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与西沙必利组比较

组别正常组模型组西沙必利组益生元组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组N/只7777777粪便含水量（p/%）治疗前44.77±1.21 30.50±0.85①30.63±1.62①30.43±1.23①30.70±1.00①30.77±1.19①30.40±1.62①治疗后44.59±1.49 30.80±1.48①39.27±1.21②41.80±0.86②③41.29±1.75②③42.30±1.34②③42.59±1.12②③粪便粒数（n/粒）治疗前53.57±5.56 37.40±5.09①37.14±4.38①36.63±5.11①37.29±3.35①37.06±5.58①36.37±5.15①治疗后52.66±6.03 35.00±2.52①39.57±3.31②44.29±4.54②③45.71±3.50②③46.71±3.95②③47.29±4.11②③

2.3 各组大鼠结肠组织病理学形态比较剖取结肠，HE 染色后通过显微镜观察结肠组织病理学变化，结果显示:各组大鼠结肠黏膜层完整，无充血、水肿、炎细胞浸润、糜烂、溃疡等异常改变，符合IBS-C之功能性胃肠病表现。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理学形态比较（HE染色）Figure 1 Comparison of the pathological features of colon tissues in various groups（by HE staining）

2.4 各组大鼠粪便微生物群落结构比较

2. 4. 1 物种相对丰度展示 根据物种注释结果，选取每个分组在门（Phylum）、属（Genus）水平上最大丰度排名前10 位的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样品在该水平上相对丰度较高的物种及其比例。如图2 所示，横坐标（sample name）是样品名，纵坐标（relative abundance）表示相对丰度，Others 表示图中这10 个门/属之外的其他所有门/属的相对丰度之和。在门水平，各组均有5 个相同的优势物种，即厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、柔膜菌门（Tenericutes），相对丰度之和所占比例均超过95%，而各个物种在各组的相对丰度却不尽相同。可见，在门水平，各组大鼠粪便菌群优势物种未变，但丰度发生了明显变化，其中厚壁菌门和拟杆菌门数量最多，变化较大；治疗后异常的菌群结构趋近于正常组，各治疗组间不尽相同，中药3 个剂量组间菌群结构更相近。

在属水平，各组均有10 个相同的优势物种:乳酸菌（Lactobacillus）、异花菌（Allobaculum）、普雷沃 氏 菌NK3B31（Prevotellaceae_NK3B31_group）、普氏菌（Prevotella_9）、Romboutsia、Alloprevotella、双歧杆菌（Bifidobacterium）、普雷沃氏菌UCG-003（Prevotellaceae_UCG - 003）、 产 气 柯 林 斯 菌（Collinsella）、Blautia；而各个菌及其总和在各组的相对丰度却不尽相同。见图3。可见，在属水平，与门水平相似，各组优势菌种未变，但菌群结构明显改变；治疗后异常的菌群结构趋近于正常组。

图2 各分组门水平上的物种相对丰度柱形图Figure 2 Comparison of the relative richness of species at phylum in various groups

图3 各分组属水平上的物种相对丰度柱形图Figure 3 Comparison of the relative abundance of species at genus in various groups

2. 4. 2 稀释曲线（rarefaction curve） 稀释曲线，是从样品中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种OTUs 的数目，以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建曲线。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种。如图4所示，曲线趋于平稳，提示本实验所采取测序数据量能够覆盖绝大多数细菌物种，满足后续分析，且模型组物种丰富度明显降低，治疗后物种丰富度趋近于正常组，其中中药高剂量组、益生元组较之更近。

图4 各组稀释曲线Figure 4 Rarefaction Curves

2. 4. 3 Alpha 多样性指数组间差异分析 本实验选用ACE 指数计算菌群丰度，其值越大，物种越丰富；Shannon 指数计算菌群多样性，其值越大，说明群落多样性越高。对不同样品的2个指数进行Wilcox 秩和检验，并通过箱形图（见图5、6）展示，可见除正常组与益生元组、中药高剂量组，西沙必利组与益生元组、中药低剂量组、中药中剂量组，益生元组、中药低剂量组与中药中剂量组之间，其余各组间均有统计学差异（P ＜0.05），其中:模型组ACE 指数值（即菌种丰度）较正常组显著降低，各治疗组ACE 指数值均较模型组升高，尤以中药高剂量组及益生元组接近正常组；各组之间Shannon 指数均无统计学差异（P ＞0.05），说明各组间菌群多样性无显著差异。

图5 各组ACE指数组间差异箱形图Figure 5 The inter-group difference box diagram of ACE

图6 Shannon指数组间差异箱形图Figure 6 The inter-group difference box diagram of Shannon

2. 4. 4 Beta Diversity 指数—距离矩阵热图 Beta多样性研究中，选用Weighted Unifrac 距离和Unweighted Unifrac 距离2 个指标来衡量2 个样品间的相异系数，其值越小，表示这2个样品在物种多样性方面存在的差异越小。以Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距离绘制的Heatmap 展示结果见图7所示:各组之间均有差异。模型组与正常组的差异最大，提示IBS-C 大鼠菌群结构明显紊乱；各治疗组与正常组的差异较模型组与正常组的差异减小，提示治疗均有效，能调节紊乱的肠道菌群，且中药高剂量组调节菌群失调作用最好。

图7 各组Beta多样性指数距离矩阵热图Figure 7 The beta diversity index chart

2. 4. 5 不加权算术平均聚类方法（UPGMA）聚类树 为了研究不同样品间的相似性，本实验通过以Weighted Unifrac 距离矩阵对样品进行UPGMA 聚类分析，构建样品的聚类树，并将聚类结果与各样品在门水平上的物种相对丰度整合展示，见图8。图8示左侧是UPGMA聚类树结构，右侧为各样品在门水平上的物种相对丰度分布图，分析表明在门水平上，微生物群根据进化关系聚类为两大分支，模型组、西沙必利组、益生元组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组聚为一支，正常组单独为一支，说明正常组的细菌群落与其他各组有明显的不同。此外，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、益生元组距离较近，表示菌群结构相似，且中药低剂量组、中药中剂量组最为相似，提示对肠道菌群改善作用接近；西沙必利组与模型组距离较近，表示菌群结构相似度高，提示西沙必利组对IBS-C模型大鼠肠道菌群紊乱改善作用相对不明显。

图8 各组不加权算术平均聚类方法（UPGMA）聚类树Figure 8 UPGMA clustering tree

3 讨论

中医古籍中并无肠易激综合征（IBS-C）病名的记载，根据其临床症状，多将其归属于“便秘”“脾约”“腹痛”“郁证”“不更衣”“阴结”“阳结”等范畴，归结其病因为饮食不节、起居失调、外邪侵袭、情志不畅、禀赋不足等，主病之脏属脾胃，与肝相关，甚则累及心、肾，病机不外乎热结、气滞、寒凝、气血阴阳亏虚引起的肠道传导失司[9]，正合《兰室秘藏·结燥论》曰:“若饥饱失节，劳逸过度，损伤胃气，及含辛热厚味之物，伏于血中，耗散真阴，津液亏少，故大便燥结。”治疗多以顺气导滞、通腑泄热、温通寒积、补益虚损、润肠通便，临床症状可缓，但难以根治，间断复发。对此，导师杨倩教授结合“浊毒理论”，着眼于当今人们生活节奏加快，社会压力增大，多食肥腻、辛辣、煎炸，食品不安全等现状，认为其病损伤脾胃，且使身心俱疲，情志不舒，木郁克土，致脾胃失健，气机失宣，水湿不运，若内停中焦，蕴久成浊，浊邪凝滞气机，致肠腑不通，郁而化热，热甚酿毒，壅滞肠腑，灼伤津液，致大肠传导失司，糟粕内停，浊毒滞留不去，使病程缠绵反复，日久变生他证。因此，提出“浊毒内蕴，腑气不通”是本病反复发作、难以治愈的关键[10]，自拟通腑降浊方，创立通腑降浊法治疗本病，见效灵验。但由于机理不明，使其应用受限，因此，我们开展此次实验研究，以求探索。

肝郁、气滞贯穿本病，往往招致郁怒，胁、腹痛、胀，本研究以柴胡、八月札、白芍疏肝理气、柔肝止痛。柴胡疏肝理气，解郁化浊，性善调达肝气，为治疗肝气郁结之要药；如《神农本草经》曰:“主心腹肠胃中结气，……推陈致新；”现代药理研究表明，其可抗炎、镇痛、提高免疫力[11]。八月札疏肝理气，健脾利胃止痛，《本草拾遗》曰:“利大小便，宣通……食之令人心宽……下气；”现代药理研究表明，其可抗炎、抗肿瘤、抗血栓[11]。白芍柔肝止痛，养血敛阴，肝体阴而用阳，本品酸敛肝阴，常配伍柴胡，养肝体，疏肝用，《滇南本草》言:“收肝气逆疼，调养心肝脾经血，舒经降气，止肝气疼痛”；现代药理研究表明，其可镇痛、解痉、抗炎[11]。方选枳实、槟榔消积导滞，通腑降浊止痛。枳实可破气除痞，行滞止痛，《药品化义》曰:“主中脘以治血分，疗脐腹间实满，消痰癖，祛停水，逐宿食，破结胸，通便闭”；现代药理研究表明，其可缓解小肠痉挛、增加胃肠收缩节律[11]。槟榔善行胃肠之气，治疗食积气滞，腹胀便秘等证，现代药理研究表明，其确可增加肠蠕动[11]。方选火麻仁、罗汉果通腑降浊，润肠通便。《药品化义》言:“麻仁，能润肠，体润能去燥，专利大肠气结便秘；”现代药理研究表明，其可刺激肠壁，促进肠道蠕动[11]。二者配伍枳实、槟榔行气导滞增通便之功。此外，方用黄连、飞扬草、冬葵子清热燥湿，化浊解毒，抗菌消炎，改善肠道菌群[11-12]；茯苓、甘草健脾益气和中，加干姜温中散寒，使浊去热清，但无碍脾胃，无过寒凉。

肠道菌群是一个复杂而庞大的微生态系统，可参与宿主的生理、生化、病理、药理及其他各方面的生理及结构的发生、发育和衰退的全过程。数量庞大的肠道菌与宿主间相互依存、相互作用，构成微生态平衡，维持机体健康。当外界环境改变，微生态平衡被破坏，从而引发各种疾病[13]，IBS 即为其中之一。本实验结果表明，通腑降浊方、西沙比利、益生元均能缓解大鼠便秘，但通腑降浊方及益生元效果更好。IBS-C 大鼠肠道确无器质性病变，但菌群紊乱，菌种丰富度下降，且多样性未变，无明显致病菌滋生，口服通腑降浊方及西沙比利、益生元均能调整紊乱的肠道菌群，但调控效果不尽相同，且不同剂量通腑降浊方作用不同。通腑降浊方高剂量组与益生元组调控作用最接近，其结果也更接近于正常组。提示上述3种药物均可通过调整患者紊乱的肠道菌群发挥对IBS-C 的治疗作用，通腑降浊方效果最好。而通腑降浊方剂量的选择对通腑降浊方的治疗效果有重要的影响。通腑降浊方疗效仍与正常大鼠保留显著差异，尚需开展更标准用药剂量、更大样本、长疗程的临床和实验研究探讨更精准的治疗方案。