清肺抑火胶囊镇咳、祛痰及平喘的药效学研究

胡茜 严钰锋 林君

[摘要]目的 观察清肺抑火胶囊镇咳、祛痰及平喘的作用及其可能机制。方法 选取清洁级ICR小鼠进行镇咳及祛痰实验，选取健康豚鼠进行平喘实验，均随机分为模型组、清肺抑火胶囊剂量组及苯海拉明组。选用二氧化硫引咳法、酚红祛痰法、组胺引喘法等模型，观察清肺抑火胶囊的疗效;以葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导A549细胞炎性因子释放模型，探讨清肺抑火胶囊可能的作用机制。结果 清肺抑火胶囊中、高剂量组及苯海拉明组小鼠的咳嗽潜伏期长于模型组和低剂量组，2 min咳嗽次数少于模型组和低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）;中、高剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;中、高剂量组的引喘潜伏期均长于模型组和低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）;在DSS诱导的细胞炎症模型中，清肺抑火胶囊处理后中、高浓度组细胞培养上清液中的白细胞介素-1β（IL-1β）水平低于DSS模型组和低浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 清肺抑火胶囊具有明显的镇咳、祛痰、平喘作用，其作用机制可能与抗组胺作用及抑制炎性因子的释放有关。

[关键词]清肺抑火胶囊;镇咳;祛痰;平喘;抗炎

[中图分类号] R978.19          [文献标识码] A          [文章編号] 1674-4721（2020）4（a）-0017-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Qingfei Yihuo Capsules in preventing cough， eliminating phlegm and relieving asthma and its possible mechanisms. Methods The clean ICR mice were selected for antitussive and expectorant experiments， and the healthy guinea pigs were selected for antiasthmatic experiments. They were randomly divided into model group， Qingfei Yihuo Capsules doses groups and Diphenhydramine group. The therapeutic effect of Qingfei Yihuo Capsules were observed using models such as the sulfur dioxide induced cough method， the expelling phlegm method with phenol red， and the histamine induced asthma. The possible mechanisms were discussed using the release model of inflammatory factors in A549 cells induced by dextran sulfate sodium salt （DSS）. Results The cough incubation period of the mice in the middle and high dose Qingfei Yihuo Capsules group and Diphenhydramine group were longer than those in the model group and low dose group， the frequency of cough within 2 minutes was fewer than that in the model group and low dose group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The secretion of phenol red from trachea in the middle and high dose Qingfei Yihuo Capsules group was higher than that in the model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The incubation period of asthma seizure in the middle and high dose Qingfei Yihuo Capsules group was longer than that in the model group and low dose group， the difference was statistically significant （P<0.05）. In the model of cellular inflammation induced by DSS， the interleukin-1β （IL-1β） levels in cell supernatants in the medium and high concentration groups after using Qingfei Yihuo Capsule were lower than those in the DSS model group and low concentration group， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Qingfei Yihuo Capsules has significant effects of preventing cough， eliminating phlegm and relieving asthma， and its possible mechanisms might be related with the anti-histamine effect and the inhibition of the release of inflammatory factors.

[Key words] Qingfei Yihuo Capsules; Preventing cough; Eliminating phlegm; Relieving asthma; Anti-inflammatory

呼吸系统疾病是一种气管、支气管、肺等部位的病变，多有咳嗽、痰多、胸痛、气喘等症状，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死[1]。《中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）》指出，目前该疾病在我国慢性病死亡病因中占第3位[2]。大气颗粒物、吸烟、工业经济发展导致的理化因子、生物因子吸入以及人口年龄老化等因素，使国内外的慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减[3]。临床上对伴有炎性反应的常见呼吸系统疾病多使用抗菌药物治疗，然而大多该类疾病并非由细菌感染引起，抗菌药物对此并无治疗效果，反而可导致细菌耐药问题[4]。在临床实践中，传统中医药因可产生良好的抗炎作用而受到广泛关注[5-6]。

本研究观察了清肺抑火胶囊对呼吸系统疾病主要症状的药效学。该胶囊由清肺抑火汤加减而成[7]，具有清肺止咳、降火生津的功效[8]。实验证明其对PM2.5所致的大鼠急性肺部损伤也具有一定的缓解作用[9]。然而，经现代工艺加工成胶囊后，目前缺少该药物對呼吸系统疾病的主要症状，如镇咳、祛痰、平喘等疗效的研究，且其发挥药效的机制仍缺乏现代药理学实验证明。本研究采用二氧化硫刺激引咳法、酚红祛痰法、药物引喘法等动物实验，以及葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导细胞炎症模型等分别展开实验，旨在探讨清肺抑火胶囊发挥镇咳、祛痰、平喘作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。

1对象与方法

1.1实验动物

镇咳及祛痰实验均采用清洁级ICR小鼠，3月龄，体重35～40 g，雌雄各半;平喘实验采用健康豚鼠，体重200～300 g，雌雄各半。以上动物均购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018-0006。本研究经上海健康医学院动物医学伦理委员会批准。

1.2药物及试剂

清肺抑火胶囊（上海方心制药科技有限公司，生产批号：20170502），用药前新鲜配置成低剂量（5 mg/ml）、中剂量（10 mg/ml）及高剂量（20 mg/ml）的混悬液（镇咳和祛痰实验），3、6及12 mg/ml的混悬液（平喘实验）;苯海拉明（遂成药业股份有限公司，生产批号：1709251），配置成0.25 mg/ml的药液;DSS（分子量约50万，生产厂家：sigmalifescience，生产批号：BCBV7157）。

1.3仪器

全波长EPOCH酶标仪（BIOTEK公司）。

1.4模型复制

1.4.1二氧化硫引咳实验[10]  取50 ml烧杯1只，内盛0.5 g无水亚硫酸钠，将盛有50%硫酸的滴定管，置于烧杯上，迅速滴入硫酸5 ml，并立即用钟罩将烧杯扣住，钟罩内充满恒定浓度的二氧化硫气体后，迅速将小鼠放入，观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和2 min内的咳嗽次数。

1.4.2酚红祛痰作用实验[11]  实验前，小鼠饥饿18 h，只供饮水。小鼠按各组剂量灌胃，30 min后按0.2 ml/10 g腹腔注射1%的酚红溶液，注射后30 min处死，分离气管，接入注射器并用5% NaHCO3溶液0.8 ml缓慢注入气管，然后轻轻吸出，如此反复3次，合并灌洗液，放置10 min使杂质沉淀，取透明红色上液，用酶标仪在波长545 nm处，测定其吸光度。

1.4.3组胺引喘实验[12]  各组豚鼠连续给药灌胃7 d，最后一次灌胃后30 min将豚鼠置于与医用超声雾化器连接的钟罩内，利用雾化器匀速喷入0.2%的磷酸组胺溶液，持续20 s，记录豚鼠引喘潜伏期（从喷雾开始到哮喘发展或抽搐跌倒的时间）。

1.4.4 DSS细胞炎症模型及白细胞介素-1β（IL-1β）的含量测定  将人肺上皮细胞株A549细胞（由复旦大学病原生物系赵超课题组惠赠）按1×105接种于24孔板中，待细胞贴壁后，用1% DSS预处理1 h，然后分别加入经0.22 μm除菌滤器过滤的清肺抑火胶囊浸出液，24 h后收集上清，用ELISA法（Human IL-1β ELISA MAXTM Deluxe，Biolegend公司）检测细胞因子IL-1β的表达水平。每个标本做复孔检测，取两次检测的均值作为最终结果。

1.5实验分组及处理

1.5.1清肺抑火胶囊的镇咳作用和祛痰作用实验  将小鼠随机分为五组，分别设为模型组、低剂量组（150 mg/kg）、中剂量组（300 mg/kg）、高剂量组（600 mg/kg）、阳性对照组（苯海拉明7.5 mg/kg）。其中镇咳实验每组8只，祛痰实验每组10只。每只小鼠予以0.3 ml/10 g药液灌胃，模型组予以0.3 ml/10 g生理盐水灌胃。

1.5.2清肺抑火胶囊的平喘作用实验  将豚鼠随机分为五组，每组10只，分别设为模型组、低剂量组（90 mg/kg）、中剂量组（180 mg/kg）、高剂量组（360 mg/kg）、阳性对照组（苯海拉明4.5 mg/kg）。每只豚鼠每次予以3 ml/100 g药液灌胃，模型组予以3 ml/100 g生理盐水灌胃。

1.5.3 DSS细胞炎症模型  按照清肺抑火胶囊浸出液处理细胞的终浓度分组，分别为低浓度组（1 μg/ml）、中浓度组（2 μg/ml）、高浓度组（4 μg/ml）。

1.6统计学方法

采用Graphpad Prism 6.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，并采用Bonferroni法进行组间的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠咳嗽潜伏期及2 min咳嗽次数的比较

低剂量组小鼠的咳嗽潜伏期及2 min咳嗽次数与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;中、高剂量组及苯海拉明组小鼠的咳嗽潜伏期长于模型组和低剂量组，2 min咳嗽次数少于模型组和低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）;中剂量组与高剂量组小鼠的咳嗽潜伏期及2 min咳嗽次数比较，差异无统计学意义（P>0.05）;苯海拉明组与中、高剂量组小鼠的咳嗽潜伏期及2 min咳嗽次数比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

与模型组比较，*P<0.05;与模型组比较，**P<0.01;与低剂量组比较，##P<0.01;“-”表示无

2.2各组小鼠呼吸道酚红分泌量的比较

低剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;中、高剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;低、中、高剂量组小鼠的呼吸道酚红分泌量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;苯海拉明组小鼠的呼吸道酚红分泌量高于模型组及低、中、高剂量组，差异均有统计学意义（P<0.01）（图1）。

与模型组比较，*P<0.05;与模型组比较，**P<0.01;与低剂量组比较，##P<0.01;与中剂量组比较，&&P<0.01;与高剂量组比较，$$P<0.01

2.3各组豚鼠引喘潜伏期的比较

低剂量组豚鼠的引喘潜伏期与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;中、高剂量组的引喘潜伏期均长于模型组和低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）;高剂量组的引喘潜伏期长于中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）;苯海拉明组的引喘潜伏期长于模型组及低、中剂量组，差异均有统计学意义（P<0.01）;苯海拉明组的引喘潜伏期与高剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

与模型组比较，**P<0.01;与低剂量组比较，##P<0.01;与中剂量组比较，&P<0.05;与中剂量组比较，&&P<0.01

2.4各组细胞培养上清液中IL-1β水平的比较

DSS刺激A549细胞，建立DSS细胞炎症模型。结果显示，DSS模型组的细胞培养上清液中IL-1β水平高于正常细胞组，差异有统计学意义（P<0.01）。用清肺抑火胶囊处理炎症模型细胞24 h后，低浓度组细胞培养上清液中的IL-1β水平高于正常细胞组，差异有统计学意义（P<0.01）;低浓度组细胞培养上清液中的IL-1β水平与DSS模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;中、高浓度组细胞培养上清液中的IL-1β水平低于DSS模型组和低浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）;中浓度组与高浓度组细胞培养上清液中的IL-1β水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。

3讨论

清肺抑火胶囊的主要成分具有清热、泻火、利咽、祛痰、免疫抑制、抗炎、抗氧化等作用[13-14]。其功能主治包括清肺止咳、降火生津，临床上还将其用于急性支气管炎风热犯肺型疾病的治疗，可有效缓解患者的临床症状[5]。此外，该药联合抗生素可减轻支气管扩张症急性加重时的发作症状[15]。然而它对肺部疾病的典型症状，如咳、痰、喘的疗效尚未有明确报道。

二氧化硫是一种较强的化学刺激性物质，小鼠吸入后，可直接刺激呼吸道感受器，反射性引起咳嗽。本实验中，给予清肺抑火胶囊后，小鼠出现剂量依赖性的咳嗽潜伏期延长，2 min内的咳嗽次数减少，提示该药有镇咳作用。其中高剂量清肺抑火胶囊的镇咳作用与苯海拉明相当。

小鼠祛痰实验结果显示，随着清肺抑火胶囊剂量的增加，小鼠呼吸道酚红分泌量增大，提示清肺抑火胶囊可增强小鼠气道分泌液体的能力。分泌的液体在呼吸道稀释痰液，达到祛痰作用。

本研究结果显示，清肺抑火胶囊中、高剂量组豚鼠的引喘潜伏期均长于模型组和低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01），提示清肺抑火胶囊可以延长组胺的引喘潜伏期。组胺具有支气管收缩作用，在支气管哮喘发作中有重要意义。本研究结果还显示，苯海拉明组的引喘潜伏期与高剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示清肺抑火胶囊可延长组胺诱导的豚鼠哮喘发作潜伏期，且中、高剂量组的平喘作用与苯海拉明相当。究其原因，清肺抑火胶囊可能通过对抗组胺、抑制支气管收缩，发挥平喘作用。

IL-1β是一种重要的炎症因子[16]，是哮喘气道平滑肌高反应性的关键调节因子[17-18]，与慢性支气管炎的咳、痰症状有关[19-20]。本研究用DSS处理人肺上皮细胞株A549后[21-22]，结果显示IL-1β分泌增加，而用清肺抑火膠囊处理后，则可明显减少该细胞受炎症刺激后炎症因子的释放，抑制IL-1β水平，达到抗炎作用。这种抗炎作用可能有助于清肺抑火胶囊镇咳、祛痰及平喘作用的发挥。

综上所述，清肺抑火胶囊剂量依赖的镇咳、祛痰和平喘作用与苯海拉明相似，且可能与其抗组胺和抗炎作用相关。

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（收稿日期：2019-10-12  本文编辑：闫  佩）