酒精通过抑制肠上皮干细胞增殖损伤肠上皮的更新修复能力*

王洪岩，徐有青，李 鑫，徐睿玲，郭淑媛，付红梅，闫朝岐

慢性酒精摄入可引起肠上皮屏障损伤、肠道通透性增加，导致“肠漏”，继而引起肠源性内毒素血症和全身系统炎症，对肝脏造成“二次打击”，加速酒精性肝病进展[1, 2]。目前，国内外已有研究证实酒精通过不同的机制对肠上皮屏障造成直接的损伤，如酒精可激活Rho/ROCK信号通路，从而影响肠上皮细胞间紧密连接蛋白的分布，导致其结构破坏和肠上皮屏障损伤[3]。酒精可增加miRNA-212过表达，后者通过改变肠上皮细胞间紧密连接蛋白组分ZO-1的表达和分布使肠上皮结构异常，导致“肠漏”的发生[4]。我们最新研究发现酒精可引起紧密连接蛋白Occludin发生细胞内吞，破坏肠上皮细胞间紧密连接结构，导致“肠漏”[5]。肠上皮更新修复的动力主要来源于肠上皮干细胞(intestinal stem cell，ISC)，ISC主要定位在肠隐窝基底部，它不断增殖、分化为成熟的肠上皮细胞，后者从隐窝基底部不断向绒毛顶端方向迁移，从而完成肠上皮的更新[6]。正常肠上皮更新修复能力很强，每3～4天更新一次，可在很大程度上弥补酒精导致的肠上皮屏障损伤，可实际并非如此。酒精处理小鼠小肠隐窝基底部增殖细胞数量明显减少，推测酒精通过抑制ISC功能，损伤肠上皮更新修复能力。我们制备慢性酒精摄入小鼠模型，采用免疫组化法检测ISC特异性标志物Lgr5的表达，检测肠隐窝基底部BrdU阳性细胞数量，研究酒精对肠上皮细胞增殖的影响，同时动态观察了Brdu阳性细胞在肠上皮的迁移情况，结果发现酒精通过抑制ISC引起肠上皮细胞的增殖和迁移能力下降，从而导致肠上皮的更新修复能力受损。

1 材料与方法

1.1 动物、药品和试剂 18只C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性，7～8周龄，体质量19～23 g，在SPF级动物实验室自由进食，室温为24±2℃，湿度为40%～70%，人工日夜循环照明。无水乙醇购自北京市通广精细化工公司(No.32061)；5-溴-2-脱氧脲苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)购自Sigma试剂公司(B5002)，-20℃保存。大鼠来源抗BrdU抗体(ab6326)、兔来源抗Lgr5(ab75732)、辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG(ab6734)和山羊抗兔IgG(ab6721)均购自Abcam公司。

1.2 慢性酒精性肝损伤小鼠模型的制备 将18只小鼠随机分为对照组(n=9)和酒精处理组(n=9)。根据Gao-Binge模型[7]进行改良，即给予含5%酒精的饲料喂养12 w，最后一次给予31.5%高浓度酒精(根据文献[7]，将95%酒精6.6 ml与水13.4 ml混合，0.25 g/ml)5 g.kg-1灌胃；对照组9只小鼠正常进食，饮用水中未添加酒精，实验前一天以生理盐水灌胃。小鼠禁食8 h，2%戊巴比妥钠(50 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，固定小鼠，剖腹，暴露腹腔，剪取小肠组织(留取近端小肠5 cm)，置于装有无菌生理盐水的培养皿中，将5毫升注射器连接灌胃针，清洗肠腔内容物，移入另一个装有无菌生理盐水的培养皿，剪成2 cm肠段，置于4%多聚甲醛固定液中。石蜡切片，脱蜡至水，制片。

1.3 肠上皮细胞增殖和迁移能力检测 在造模成功后取材前，一次性腹腔注射BrdU(50 mg.kg-1)，分别在注射后2 h、24 h和72 h取材，每个时间点取3只小鼠。取小肠组织，石蜡包埋、切片，采用免疫组化法检测BrdU阳性细胞。以注射BrdU后2 h时每个小肠隐窝BrdU阳性细胞数反映肠上皮细胞的增殖，动态观察三个时间点小肠绒毛最远端BrdU阳性细胞距小肠隐窝基底部的距离，间接反映肠上皮细胞的迁移程度，使用Image J软件测量。

1.4 ISC特异性标志物Lgr5表达检测 采用免疫组化法，取石蜡切片，60℃烤片120 min；标准流程脱蜡、水化，PBST洗3次，每次5 min；加3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶15～30 min；柠檬酸微波/高压修复，室温冷却；PBST洗3次，每次5 min；加一抗，4℃过夜；用PBST洗3次，每次5 min；加二抗，室温30 min；PBST洗3次，每次5 min；加DAB显色，自来水冲洗；苏木素复染，自来水冲洗；脱水透明，中性树胶封片。

2 结果

2.1 小肠绒毛形态结构的变化 在光镜下，与对照组小鼠比，酒精处理组小鼠小肠绒毛形态结构大致完整，但小肠绒毛高度明显缩短、萎缩，绒毛间隙增加(图1)。

图1 两组小鼠小肠绒毛形态表现酒精处理组小鼠小肠绒毛明显缩短、萎缩, 绒毛间隙增加(HE，bar=100 μm)

2.2 两组小鼠肠隐窝Lgr5表达情况比较 酒精处理组ISC特异性标志物Lgr5表达明显低于对照组(图2)。

图2 两组小鼠肠隐窝ISC特异性标志物Lgr5表达情况(免疫组化, bar=25μm, 箭头所示为Lgr5阳性的ISC)对照组小鼠肠隐窝基底部可见少量Lgr5阳性表达, 酒精处理组Lgr5表达缺失

2.3 酒精抑制肠上皮细胞的增殖 酒精处理组小鼠每个肠隐窝BrdU阳性细胞数量为(3.50±0.65)个/肠隐窝，明显低于对照组的【(7.90±1.08)个/肠隐窝，P<0.05，图3A】；免疫组化结果显示对照组小鼠小肠隐窝基底部BrdU阳性细胞数量较多，显色清晰，而酒精处理组小鼠小肠隐窝基底部BrdU阳性细胞数量减少，显色模糊、融合(图3B)。

图3 两组小鼠肠隐窝BrdU阳性细胞数量和形态表现(免疫组化，bar=50μm)A：酒精处理组小鼠肠隐窝BrdU阳性细胞数显著下降(*P<0.05)；B：对照组BrdU阳性细胞数量较多, 结构清晰，而酒精处理组细胞数量明显减少，显色模糊融合

2.4 酒精抑制肠上皮细胞的迁移 在注射BrdU后72 h，对照组小鼠肠上皮细胞从小肠隐窝基底部迁移至绒毛顶端，而酒精处理组小鼠肠上皮细胞的迁移显著滞后(图4)。在2 h、24 h和72 h，酒精处理组小鼠小肠绒毛最远端BrdU阳性细胞距肠隐窝基底部的距离分别为(66.67±1.60)μm、(219.40±12.11)μm和(313.90±9.76)μm，显著短于对照组【分别为(111.10±1.60)μm、(319.00±10.04)μm和(625.90±3.34)μm，P<0.05】。

图4 两组小鼠肠上皮细胞迁移情况比较(免疫组化，bar=50 μm)A：腹腔注射Brdu 2 h、24 h和72 h，酒精处理组小鼠小肠绒毛最远端BrdU阳性细胞距肠隐窝基底部的距离(即肠上皮细胞的迁移距离)均显著短于对照组(*P<0.05)；B：两组小鼠小肠BrdU阳性细胞迁移表现

3 讨论

国内外关于酒精对ISC和肠上皮更新修复功能影响的研究甚少。在1987 年，一项研究发现长期慢性酒精摄入小鼠肠上皮隐窝细胞增殖率明显低于对照组[8]。随着ISC特异性标志物(如Lgr5、Bmi1)的发现[9-11]，关于酒精对ISC影响的研究进入一个新篇章。酒精可以明显降低小鼠小肠组织和体外培养的小肠来源肠类器官ISC标记蛋白Lgr5的表达，并可抑制体外培养的小肠来源肠类器官的生长，提示酒精能抑制ISC的功能[12]。虽然酒精没有明显改变小鼠结肠组织和结肠来源肠类器官Lgr5的表达，但却可以改变ISC的分化方向，即它降低了ISC向肠上皮吸收细胞分化，而增加ISC向肠内分泌细胞分化，从而影响肠上皮屏障的完整性，导致结肠通透性增高[13]。我们前期的研究也发现与对照组小鼠相比，酒精处理组小鼠肠隐窝基底部增殖细胞数量明显降低。

肠上皮的更新修复动力来源于ISC，它位于肠隐窝内，具有自我更新和增殖分化功能，并受干细胞巢中多种信号通路的调节。一个肠隐窝内4～6个干细胞中只有一个表现为干细胞功能，其余的处于静止状态，前者可产生多能祖细胞(亦称短暂增殖细胞)，具有很强的增殖和分化能力，它们每 12～16 小时分裂一次，经过 6 次细胞分裂，即离开隐窝向绒毛方向迁移，逐步分化成肠道另外四种上皮细胞，包括吸收细胞、杯状细胞、内分泌细胞和潘氏细胞，前三种细胞向肠腔绒毛顶端方向迁移，当到达绒毛顶端之后经历凋亡和脱落，起到肠上皮更新修复的作用[14-16]。本研究显示，酒精处理组小鼠小肠绒毛形态结构大致完整，但与对照组相比，酒精处理组小鼠绒毛高度明显缩短、萎缩，提示酒精损伤了肠上皮的更新修复能力。本研究显示酒精可以明显抑制ISC特异性标志物Lgr5的表达，提示酒精可导致ISC数量或功能的抑制，与Lu R et al[12]研究结果一致。酒精抑制ISC后，如何影响肠上皮的更新修复能力，我们分别检测了酒精对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响。BrdU为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶掺入DNA合成，活体注射或加入细胞培养，再采用抗BrdU单克隆抗体进行显色可显示增殖细胞[17, 18]。只有增殖活跃有DNA合成的细胞才会掺入BrdU显色，而肠上皮隐窝是增殖最为活跃的位置。肠上皮细胞3～4天更新一次，肠隐窝基底部细胞会沿着隐窝-绒毛轴向绒毛顶端迁移，直至凋亡脱落，完成肠上皮的更新修复[19, 20]。给小鼠一次性腹腔注射BrdU后，观察小肠组织BrdU阳性细胞从肠隐窝向绒毛顶端迁移的过程，结果显示酒精处理组小鼠小肠隐窝基底部BrdU阳性细胞数量明显低于对照组小鼠，说明酒精抑制肠上皮细胞的增殖。动态观察BrdU阳性细胞的迁移情况发现，正常小鼠小肠隐窝基底部的BrdU阳性细胞在第3天即可迁移至绒毛顶端，而酒精处理组小鼠肠上皮细胞的迁移明显滞后。以上结果说明酒精通过抑制ISC功能，导致肠上皮细胞的增殖和迁移能力明显降低，从而损伤肠上皮的更新修复能力。