不同处理方式对土壤细菌多样性的影响

于凯悦 李唯一 刘宇航 董爱荣 刘薇

摘 要：本文采用高通量测序法，探究短密木霉（Trichoderma brevicompactum）、大豆和咪唑乙烟酸三者分别处理以及共同作用对土壤细菌多样性和群落结构的影响。试验以不含上述3种物质的土壤为阴性对照。结果表明：5个不同处理样品共含有36 336个细菌OTU（operational taxonomic unit），其中共有的细菌种类有1 031个，仅占样品细菌总数的2.84%;不同处理土壤样品的细菌多样性均发生变化，短密木霉、大豆对土壤细菌多样性的影响小于咪唑乙烟酸;不同处理样品的细菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。变形菌门（Proteobacteria）是5个样品中的优势细菌，平均丰度为50.82%;在属的水平下，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是5个样品中的优势细菌，其次是芽单胞菌属（Gemmatimonas）和微小杆菌属（Exiguobacterium）。结论：土壤中加入短密木霉后，土壤细菌多样性及物种总数略微下降;种植大豆后，土壤细菌多样性及物种总数升高;加入咪唑乙烟酸后，土壤细菌多样性及物种总數显著降低;短密木霉及大豆对土壤细菌多样性及物种总数的影响小于咪唑乙烟酸。

关键词：高通量测序法;短密木霉;咪唑乙烟酸;大豆;多样性

Abstract：In this paper， high-throughput sequencing was used to investigate the effects of the interactions between Trichoderma brevicompactum， soybean and imazethapyr on soil bacterial diversity and community structure. The soil without the above three substances was used as the negative control. The results showed that： five different treatment samples contained a total of 36 336 bacterial OTUs， of which 1 031 were bacterial species presented in all samples， accounting for only 2.84% of the total bacteria. The bacterial diversity of soil samples under different treatments had changed， and the effect of T. brevicompactum and soybean on soil bacterial diversity was less than that of imazethapyr. The composition of the bacterial community structure was basically the same in different treatment samples， but the relative abundance was very different. Proteobacteria was the dominant bacteria in five samples， with an average abundance of 50.82%; at the genus level， Sphingomonas was the predominant bacterium in the five samples， followed by Gemmatimonas and Exiguobacterium. Conclusion： After adding T. brevicompactum to the soil， the soil bacterial diversity and total species decreased slightly; after planting soybeans， the soil bacterial diversity and total species increased; after adding imazethapyr， the soil bacterial diversity and total species decreased significantly; the effects of T. brevicompactum and soybean on soil bacterial diversity and total species were less than that of imazethapyr.

Keywords：High-throughput sequencing; Trichoderma brevicompactum; imazethapyr; soybean; diversity

0 引言

随着农业技术的不断发展，农药的运用逐渐增多，其中，咪唑乙烟酸具有活性高、用量低和选择性广等优点，在农业市场中占有重要地位[1]，常用于大豆和苜蓿等豆科作物防除众多一年生和多年生禾本科杂草及阔叶杂草[2]。咪唑乙烟酸可以在大豆体内快速分解，半衰期仅1～6 d，但其残留期较长，在施用后3 a内不可种植除大豆以外的作物，尤其以经济作物，如紫苏、白菜、小麦和甘蔗等最为敏感，会对后茬农作物种植产生严重影响[3]，还可能残留于地下水中，对人们的生活用水造成一定的影响[4]。

目前如果对土壤微生物多样性方面采用传统方法（如：平板划线法或直接稀释后染色并镜检[5]）会存在工作量大培养时间长等缺点[6]，相比较而言，高通量测序法更为准确快捷[7]，同时有利于对实验室培养条件下容易忽略的低丰度菌群种类进行探究[8-9]。

本研究基于高通量测序法，利用盆栽模拟试验分析短密木霉、大豆、咪唑乙烟酸单独及三者相互作用对细菌多样性和菌落结构的影响，为咪唑乙烟酸的生物降解提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盆栽试验土壤按m草炭∶m沙子∶m土=5∶3∶2比例进行混合。大豆品种采用黑农48。实验采用的菌种短密木霉（Trichoderma brevicompactum）为课题组前期驯化得到的高效降解菌株。分离真菌的培养基采用孟加拉红培养基[10]。保存菌株采用PDA培养基[11]。

1.2 盆栽试验

将短密木霉（T. brevicompactum）接种于60个PDA培养皿中，在25 ℃、黑暗条件下的培养箱中培养36 h，待菌株大量产孢后，将菌丝连同孢子刮下，加入到盛有无菌水的烧杯中，放入少量的吐温80，用玻璃棒充分的搅拌后均匀地混入部分试验用土壤中，再将已经配置好的5%咪唑乙烟酸水剂按照50 mg/kg的质量分数混入部分实验土壤。每盆放入15粒均匀、饱满、无病虫害的大豆种子，盖上适量的土，给予适宜的温度、水分和光照，使其自然生长[12]。

以短密木霉（T. brevicompactum）为降解菌，按表1设计盆栽试验。试验组在处理后30 d用五点法取土样，风干，过10目筛，放入冰箱4 ℃保存待用[13]。

1.3 样品基因组提取

参照E Z N ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒的使用说明书，提取土壤样品 DNA，利用Tris盐酸缓冲液洗脱DNA，并置于-20 ℃ 条件下冻存，送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S r RNA 基因扩增子测序。

1.4 数据分析

选择基因序列号为341 F和805 R作为引物，引物序列分别为CCTACGGGNGGCWGCAG和GACTACHVGGGTATCTAATCC，利用Illumina Mi Seq平台进行测序和分析。下机数据经过 QIIME（v1.8.0）软件过滤、拼接和去除嵌合体，去除各样本中reads尾部质量值在20以下的碱基，切除reads中含N的序列，并去除数据中的短序列，长度阈值200 bp，随后再对低复杂度的序列进行过滤。

采用Usearch （version 7.1）软件进行数据处理，物种比对注释使用 RDP classifier 软件，保留置信区间大于 0.8 的注释结果。利用Mothur软件进行Chao1指数、香农指数（Shannon）计算分析，并在各分类水平上进行群落结构的统计分析，得到微生物群落结构组成。

2 结果与分析

2.1 不同处理样品的细菌多样性分析

Shannon指数是用来估算样品中微生物多样性指数之一，常用于反映alpha多样性指数[14]。Shannon值越大，说明微生物多样性越高。Chao1指数在生态学中常用来估计物种总数[15]。对5个不同处理样品的OTU（operational taxonomic unit）数、Shannon指数和Chao1指数进行比较分析，结果见表2。由表2可知，不同处理样品分别检测到7 653、7 478、7 682、6 571、6 952个细菌OTU，跟CK相比，样品A1的OTU数、Shannon指数和Chao1指数略微下降，说明土壤加入短密木霉后，对其他微生物产生一定的抑制作用，土壤细菌多样性及物种总数略微下降;样品A2的OTU数、Shannon指数和Chao1指数最高，在一定程度上说明种植大豆后，土壤细菌多样性及物种总数升高;样品A3的OTU数、Shannon指数和Chao1指数最低，说明咪唑乙烟酸对土壤细菌多样性及物种总数影响很大;样品A4的OTU数、Shannon指数和Chao1指数均高于样品A3，说明三者互作中，添加短密木霉及大豆后咪唑乙烟酸对土壤细菌多样性及物种总数影响在一定程度上减少。一方面由于短密木霉降解部分咪唑乙烟酸，降低土壤中咪唑乙烟酸的浓度，同时大豆的种植对土壤细菌多样性及物种总数的积极影响，使三者相互作用，对土壤细菌多样性及物种总数影响小于单独添加咪唑乙烟酸。而样品4和样品3的Shannon指数相近，Chao1指数却相差很大，这是由于处理组之间物种种类虽多，但物种分布不均匀。

2.2 不同处理样品的细菌群落结构差异性分析

由图2可知，从微生物分类的门水平上来看，5个样品主要含有10个门的细菌，包括：变形菌门（Proteobacteria ）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）、检菌总门（Parcubacteria）。在门水平下，不同处理样品的细菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。这也说明土壤样品经过不同处理后，群落结构不会发生根本改变。变形菌门（Proteobacteria）是5个样品中的优势细菌，其中，A4样品的丰度最大，为58.45%，A2样品的丰度最小，为42.89%。其次是酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），平均丰度分别为10.74%、10.46%。其他门以及未鉴定的细菌平均丰度均在5%以下。

根据物种分类结果，由于样品中所检测出的微生物种类繁多，许多物种含量相对较少，因此选择细菌丰度前20的物种进行分类统计，如图3所示。由图3可知，从微生物分类的属水平角度来看，5个样品丰度前20个属的细菌有：鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、Gaiella、Rhizomicrobium、红游动菌属（Rhodoplanes）、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Phenylobacterium、檸檬酸杆菌属（Citrobacter）、Rhodoferax、Rudaea、溶杆菌属（Lysobacter）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、产卟啉杆菌属（Porphyrobacter）、Methylophilus、不动杆菌属（Acinetobacter）、类诺卡氏属（Nocardioides）、孢鱼菌属（Sporichthya）、假单胞菌（Pseudomonas）及德沃斯氏菌属（Devosia）。在属水平下，不同处理样品的细菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是5个样品中的优势细菌，其中，A3样品的丰度最大，为11.09%，其次是A4样品，丰度为9.31%，CK样品的丰度最小，为6.1%。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）细菌可用于芳香化合物的生物降解，加入咪唑乙烟酸后，可能促进了鞘氨醇单胞菌属细菌的增殖。其次是芽单胞菌属（Gemmatimonas），平均丰度为6.86%，而后是微小杆菌属（Exiguobacterium），平均丰度为5.96%，而其他前20属细菌平均丰度均在5%以下，其余已鉴定属合计平均丰度38.7%，占很大比例。

3 討论与结论

本研究表明，土壤中加入短密木霉后，土壤细菌多样性及物种总数略微下降，这与李雪萍的实验结果相似[17];种植大豆后，土壤细菌多样性及物种总数升高，这与张健的研究结果相一致[18];加入咪唑乙烟酸后，土壤细菌多样性及物种总数显著降低，这与戎丽丽的实验结论一致[19]。总的来说短密木霉及大豆对土壤细菌多样性及物种总数的影响小于咪唑乙烟酸。

不同处理样品中的细菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。在门水平下，变形菌门（Proteobacteria ）是5个样品中的优势细菌，其次是酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）。在属的水平下，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是5个样品中的优势细菌，其次是芽单胞菌属（Gemmatimonas）和微小杆菌属（Exiguobacterium）。

【参 考 文 献】

[1]周超，路兴涛，张勇，等.咪唑乙烟酸对花生后茬作物安全性评价[J].花生学报，2018，47（4）：41-46.

ZHOU C， LU X T， ZHANG Y， et al. Safety evaluation of imazethapyr on peanut stubble crops[J]. Journal of Peanut， 2018，47 （4）： 41-46.

[2]柏亚罗，石凌波.三嗪类除草剂的全球市场及发展前景[J].现代农药，2018，17（3）：1-8.

BAI Y L， SHI L B. Global market and development prospect of triazine herbicides[J]. Modern Pesticides， 2018，17 （3）： 1-8.

[3]卢美名，尹雯悦，刘传龙，等.除草剂微生物降解的研究进展[J].湖北农业科学，2019，58（3）：5-8.

LU M M， YIN W Y， LIU C L， et al. Research progress on biodegradation of herbicides[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2019， 58（3）： 5-8.

[4]PREZ-IGLESIAS J M， SOLONESKI S， NIKOLOFF N， et al. Toxic and genotoxic effects of the imazethapyr-based herbicide formulation Pivot H on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles （Anura， Hylidae）[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2015， 119： 15-24.

[5]董宏鑫，时铭泽.土壤微生物分离与测定[J].吉林农业，2018，25（20）：72.

DONG H X， SHI M Z. Isolation and determination of soil microorganism[J]. Jilin Agriculture， 2018， 25（20）： 72.

[6]康捷，章淑艳，韩韬，等.麻山药不同生长时期根际土壤微生物多样性及群落结构特征[J].生物技术通报，2019，35（9）：99-106.

KANG J， ZHANG S Y， HAN T， et al. Microbial diversity and community structure characteristics of yam rhizosphere soil at different development periods[J]. Biotechnology Bulletin， 2019， 35（9）： 99-106.

[7]李妍，徐兴祥.高通量测序技术的研究进展[J].中国医学工程，2019，27（3）：32-37.

LI Y， XU X X. Research progress of high-throughput sequencing technology[J]. China Medical Engineering， 2019， 27（3）： 32-37.

[8]YOU Y M， WANG J， HUANG X M， et al. Relating microbial community structure to functioning in forest soil organic carbon transformation and turnover[J]. Ecology and Evolution， 2014， 4（5）： 633-647.

[9]樊兰英，闫丽娟.省域尺度油松人工林生产力与土壤养分关系研究[J].林业科技，2018，43（6）：14-16.

FAN L Y， YAN L J. Study on relationship of forest productivity and soil nutrients of Pinus tabuliformis plantation in provincial scale[J]. Forestry Science & Technology， 2018， 43（6）：14-16.

[10]林润泽.东北农田木霉菌的鉴定、酶活评价及其纤维素酶发酵工艺[D].沈阳：沈阳农业大学，2016.

LIN R Z. Northeast farmland Trichoderma collect identification， evaluation and cellulase activity optimization of fermentation conditions[D]. Shenyang： Shenyang Agricultural University， 2016.

[11]喬新荣，叶润，刘红云，等.猫爪草内生真菌的分离、鉴定及抑菌活性的初步研究[J].黑龙江畜牧兽医，2019，62（22）：128-132.

QIAO X R， YE R， LIU H Y， et al. Isolation， identification and antimicrobial activity of Endophytic Fungi from Ranunculus ternatus[J]. Heilongjiang Animal Husbandry and veterinary， 2019 ，62（22）： 128-132.

[12]黄春艳，王宇，李静，等.农药降解菌剂缓解玉米咪唑乙烟酸残留药害的效果[C]//2014年中国植物保护学会学术年会论文集.厦门，2014：251-255.

WANG C Y， WANG Y， LI J， et al. The effect of pesticide degrading bacteria on relieving residual pesticide damage of imazethapyranoic acid [C]// Proceedings of 2014 annual meeting of Chinese society of plant protection， Xiamen， 2014： 251-255.

[13]刘晴，董爱荣，邓世林，等.降解菌短密木霉对土壤酶活性的影响[J].森林工程，2019，35（3）：9-12.

LIU Q， DONG A R， DENG S L， et al. Effect of Trichoderma brevis on soil enzyme activity[J]. Forest Engineering， 2019， 35 （3）： 9-12.

[14]牛晓燕.大兴安岭天然林演替和人工林生长对于土壤微生物多样性动态的影响[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2017.

NIU X Y. The impact of natural forest succession and planted forest growth on soil microorganism diversity in Greater Xingan mountains[D]. Hohhot： Inner Mongolia Agricultural University， 2017.

[15]曹辉，李燕歌，周春然，等.炭化苹果枝对苹果根区土壤细菌和真菌多样性的影响[J].中国农业科学，2016，49（17）：3412-3423.

CAO H， LI Y G， ZHOU C R， et al. Effect of carbonized apple branches on bacterial and fungal diversities in apple root-zone soil[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2016， 49（17）： 3412-3423.

[16]艾叶，谢泰祥，刘江枫，等.竹叶兰根系共生真菌群落结构及生物学功能初探[J].菌物学报，2019，38（10）：1631-1642.

AI Y， XIE T X， LIU J F， et al. Community structure and biological function of the root symbiotic fungi of Arundina graminifolia[J]. Mycosystema， 2019， 38（10）： 1631-1642.

[17]李雪萍.青藏高原青稞根腐类病害及其对根际土壤微生态的影响[D].兰州：甘肃农业大学，2017.

LI X P. Naked barley root rot diseases and influence on its rhizosphere microecology in Qinghai-Tibet Plateau， China[D]. Lanzhou： Gansu Agricultural University， 2017.

[18]张健.接种费氏中华根瘤菌WGF03及其硫代谢突变体对大豆生长和根际细菌群落的影响[D].南宁：广西大学，2014.

ZHANG J. Effects of inoculation of Sinorhizobium fermii wgf03 and its thiocatabolic mutants on soybean growth and rhizosphere bacterial community[D]. Nanning： Guangxi University， 2014.

[19]戎丽丽.异恶草酮残留检测方法的建立及对土壤微生物的影响[D].哈尔滨：东北农业大学，2018.

RONG L L. Establishment of a method for determination of clomazone residues and its effect on soil microorganisms [D]. Harbin： Northeast Agricultural University， 2018.