不同抗生素的浓度对百合鳞片再生的影响

张小平

(云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201)

1 引言

百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的总称，是世界第五大鲜切花卉，也是我国重要的大宗中药材和特色蔬菜，具有极高的观赏、药用和食用价值。同时，中国作为世界百合(Lilium spp.)种质资源的分布中心，拥有世界上50%以上百合属植物[1]。但目前百合属中一些分布区域狭窄或生态适应性较弱的种的生存受到了严重威胁，例如绿花百合(Lilium fargesii)，亟需对其进行抢救和保护[2]。植物组织培养技术作为珍惜植物资源保护最有效的手段在许多植物上得到了成功应用，但由于百合组培主要以生长在土壤中并且没有外膜包被的鳞茎为外植体，组培过程中污染率极高，极不利于一些珍稀百合资源的抢救和保护。而在许多主要农作物中得到成功应用的植物转基因技术在百合上的应用将极大加速百合花色、抗性及品质育种的进程，并且国内外研究工作者已经进行了一些有益的尝试。但作为遗传转化重要基础工作的抗生素对百合再生的影响却缺乏系统研究，限制了转基因技术在百合品种改良中的应用。

本研究通过研究兰州百合、OT型百合“木门”及东方百合“索邦”试管鳞茎的鳞片在附加不同浓度的头孢噻肟钠、卡那霉素及潮霉素的再生培养基上的存活及再生情况，明确不同抗生素及其浓度对百合的影响，确定适合百合组培的脱菌剂及遗传转化过程中进行转化子筛选的抗生素种类和适宜的浓度，从而为百合遗传转化及组培过程中细菌污染中抗生素的使用提供依据。

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

本研究以兰州百合、OT型百合“木门”及东方百合“索邦”脱毒试管鳞茎为材料。

2.1.2 所用药品

主要药品为MS培养基、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA、卡那霉素(Kan)、头孢噻肟钠(Cef)及潮霉素(Hyg)。

2.2 试验方法

以附加1.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的头孢噻肟钠(Cef)(200 mg/L，250 mg/L，300 mg/L)、卡那霉素(Kan)(20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L，100 mg/L，120 mg/L，150 mg/L)及潮霉素(Hyg)(10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L，25 mg/L，30 mg/L，35 mg/L)，以不添加抗生素为对照，每个处理接种40鳞片切块，重复3次，60d后调查统计Cef、Kan和 Hyg对百合鳞片再生的影响。培养温度23±2 ℃，光照强度1500～2000 Lx，光照时间14 h/d，

3 结果与分析

3.1 不同浓度的头孢噻肟钠对百合鳞片再生的影响

由表1，图1、2可知，在添加了3种浓度的头孢噻肟钠(Cef)的培养基上，兰州百合、“木门”和“索邦”鳞片切块均能存活，并且产生不定芽的数量在同种百合之间差异较小，尤其是“木门”和“索邦”之间差异更小。当Cef浓度为300 mg/L时，兰州百合鳞片再生率最高，250 mg/L时鳞片再生率则最低；“木门”在200 mg/L和300 mg/L的Cef浓度下鳞片再生率均最高，250 mg/L时鳞片再生率也最低；相反，“索邦”百合在250 mg/L的Cef浓度下，鳞片再生率最高，而在200 mg/L和300 mg/L的浓度下鳞片再生率最低。在200 mg/LCef浓度下，兰州百合、“木门”和“索邦”鳞片的分化率分别为87.5%、100%和97.0%；当Cef浓度为250 mg/L时，兰州百合、“木门”和“索邦”百合分化率达到85%、97.5%和100%；当Cef浓度升高至300 mg/L时，兰州百合、“木门”和“索邦”百合分化率达到97.5%、100%和97.5%，不会导致鳞片褐变或白化死亡，百合鳞片再生也并未受到影响。换言之，随着Cef浓度的升高，百合鳞片的分化率呈先下降后上升的趋势，而且3种百合对Cef的耐受能力依次为：“木门”>“索邦”>兰州百合。由此可见，在遗传转化中，为了减少Cef对百合鳞片再生的伤害，同时又能够有效地抑菌，Cef浓度选择300 mg/L是可行的。

表1 不同浓度的头孢噻肟钠对百合鳞片再生的影响

注：a兰州百合,Cef 0 mg/L;b.兰州百合,Cef 200 mg/L;c.兰州百合,Cef 250 mg/L;d.兰州百合,Cef 300 mg/L;e.“木门”百合,Cef 0 mg/L;f.“木门”百合,Cef 200 mg/L;g.“木门”百合,Cef 250 mg/L;h.“木门”百合,Cef 300 mg/L;i.“索邦”百合,Cef 200 mg/L;j.“索邦”百合,Cef 250 mg/L;k.“索邦”百合,Cef 200 mg/L;l.“索邦”百合,Cef 250 mg/L

图1 不同浓度的头孢噻肟钠对百合鳞片的影响

3.2 不同浓度的卡那霉素对百合鳞片再生的影响

由表2、图3～5可知，不同浓度的Kan会对百合鳞片存活和再生产生不同程度的影响。随着Kan浓度升高，百合鳞片切块存活率和再生率逐渐降低，且再生芽出现白化。3种百合中，兰州百合对Kan浓度增加响应最为明显，当Kan浓度为20 mg/L时，兰州百合鳞片再生频率为97.5%；当浓度升高至40 mg/L时，兰州百合鳞片可以形成大量不定芽，但大部分不定芽呈浅黄色，随着培养时间点延长逐渐变成白化，只有少量最终发育成苗，再生率为12.5%；当Kan浓度为60 mg/L时，再生芽形成严重受到抑制，只有5%的鳞片能形成再生；而当Kan为100 mg/L或更高时，彻底抑制了兰州百合鳞片的分化，没有不定芽及突起产生。相比兰州百合，“木门”及“索邦”对Kan具有较强的耐受能力，当Kan浓度为80 mg/L时，“木门”及“索邦”鳞片再生频率分别为52.5%和57.5%，且只有少量鳞片出现白化现象；当Kan浓度为100 mg/L时，“木门”及“索邦”也能形成较多不定芽或突起，但是其中大部分逐渐白化，只有少量可以最终分化成苗，鳞片再生频率显著降低，分别为17.5%和20%；当浓度高于120 mg/L时，鳞片再生受到显著抑制，大部分突起白化且停止继续分化。

图2 鳞片再生频率随头孢噻肟钠浓度的变化

表2 不同浓度的卡那霉素对百合鳞片再生的影响

注：a兰州百合,Kan 0 mg/L;b. 兰州百合,Kan 20 mg/L;c. 兰州百合,Kan 40 mg/L;d. 兰州百合,Kan 60 mg/L;e. 兰州百合,Kan 80 mg/L;f. 兰州百合,Kan 100 mg/L;g. 兰州百合,Kan 120 mg/L;h. 兰州百合,Kan 150 mg/L;i. “木门”百合;Kan 0 mg/L;j.“木门”百合,Kan 20 mg/L;k.“木门”百合,Kan 40 mg/L;l.“木门”百合,Kan 60 mg/L;m.“木门”百合,Kan 80 mg/L;n.“木门”百合,Kan 100 mg/L;o.“木门”百合,Kan 120 mg/L;p.“木门”百合,Kan 150 mg/L;q.“索邦”百合,Kan 0 mg/L;r.“索邦”百合,Kan 20 mg/L;s.“索邦”百合,Kan 40 mg/L;t.“索邦”百合,Kan 60 mg/L;u.“索邦”百合,Kan 80 mg/L;v.“索邦”百合,Kan 100 mg/L;w.“索邦”百合,Kan 120 mg/L;x.“索邦”百合,Kan 150 mg/L

图3 不同浓度的卡那霉素对百合鳞片再生的影响

图4 鳞片再生频率随卡那霉素浓度的变化

图5 褐变死亡鳞片数随卡那霉素浓度的变化

3.3 不同浓度的潮霉素对百合鳞片再生的影响

由表3、图6-8可知，随着Hyg浓度的升高，3种百合的鳞片再生频率逐渐降低，褐变死亡鳞片数逐渐增加，对鳞片致死率逐渐增大。在这三种百合中，兰州百合对Hyg的耐受能力最低，OT型“木门”百合和东方百合“索邦”对Hyg的耐受性相近。当Hyg浓度为25 mg/L时，兰州百合鳞片再生频率降至20%，较多鳞片开始褐变死亡，明显抑制了鳞片再生；低于该浓度时，随着Hyg浓度的增加，鳞片再生频率呈升高的趋势，但是再生苗数量过多，无法达到筛选转化植株的作用；而高于该浓度时，兰州百合鳞片基本被完全抑制，再生频率为0，且鳞片几乎全部相继白化腐软。当Hyg浓度为25 mg/L时，“木门”和“索邦”鳞片再生率均显著降低，分别为27.5%和30%，少量鳞片开始白化腐软，随之褐化死亡；当Hyg浓度升高至30时，大量鳞片开始褐变死亡，鳞片再生受到显著抑制，再生频率分别为10%和12.5%；当Hyg浓度达到35 mg/L时，鳞片再生频率骤降且植株生长状况不佳，Hyg对鳞片的毒害作用增强，再生芽苗很快也会褐化死亡；而低于30 mg/L时，再生苗数量过多，不利于筛选。

同时，可观察到，随着时间培养时间的增加，鳞片褐化率不断增加，再生芽也会逐渐褐化死亡，而且Hyg浓度越高后期鳞片或再生苗死亡速度越快。前人研究表明，在筛选质量浓度时一般应略低于全致死浓度[3]；因此，在遗传转化中，兰州百合选择25 mg/LHyg是可行的，而“木门”和“索邦”以30 mg/LHyg为宜。

表3 不同浓度的潮霉素对百合鳞片再生的影响

4 讨论与结论

有关植物抗生素敏感性研究已有很多报道，但是不同植物对不同抗生素的敏感性存在很大差异。本研究发现，百合对三种抗生素敏感性存在较大差异，对Hyg的敏感性最高，其次是Kan，对Cef的敏感性最差，Cef浓度为300 mgL时仍然对鳞片再生没有明显影响。同时，Kan和Hyg对百合再生的影响也不一样，Kan主要是引起组织及再生芽白化，而Hyg则引起鳞片褐化死亡，这与两种抗生素对植物细胞的作用机制有关。这三种百合对同种抗生素的耐受力也存在差异，与OT型百合“木门”和东方百合“索邦”相比，兰州百合鳞片再生对Kan和Hyg耐受性要弱得多，而“木门”和 “索邦”对两种抗生素的敏感程度相当。

抗生素作为农杆菌介导的遗传转化及植物组织培养中细菌污染的脱菌剂，要求其既能有效抑制或杀死细菌，但又对植物生长、分化不产生明显影响。本研究所用的三种抗生素中Cef对百合鳞片再生的影响最小，当Cef浓度为 300 mg/L时，兰州百合、“木门”和“索邦”的鳞片再生频率分别为97.5%、100%和97.5%，而300 mg/L的Cef也足以抑制或杀死农杆菌及所有的敏感细菌，是适合百合的脱菌抗生素，适宜的浓度为300 mg/L。

作为遗传转化中高效的筛选抗生素，不仅要有效地抑制非转化细胞生长，使之缓慢死亡，还要不影响转化细胞的正常生长。当选择压低时，部分未转化的植物细胞由于耐受性而分化再生成植株；当选择压高时，真转化子由于不能承受高选择压而同样被抑制，使转化率降低[4]。卡那霉素(Kan)是一种植物遗传转化中常用的筛选标记，本研究结果表明，当Kan浓度为40 mg/L 时，兰州百合鳞片能形成大量不定芽，但只有少量最终发育成苗，再生率为12.5%；当Kan浓度低于该浓度，再生苗数量太多，达不到筛选的目的，而高于该浓度，筛选压过大，可能导致转化细胞被杀死，转化效率低下。所以，适合兰州百合转化子筛选的Kan浓度是40 mg/L。当Kan浓度为100 mg/L 时，“木门”和“索邦”鳞片能形成大量不定芽或突起，但是其中大部分停止在白化状态，只有少量继续分化成苗，再生率分别为17.%和20%，故而，该浓度是“木门”和“索邦”的遗传转化最适宜的筛选浓度。这与陈莉等[5]和焦子源[6]的研究结果不一致，可能是由于受体材料的不同所导致的。

注：a.兰州百合,Hyg 0 mg/L;b.兰州百合,Hyg 10 mg/Lc.兰州百合,Hyg 15 mg/L;d.兰州百合,Hyg 20 mg/L;e.兰州百合,Hyg 25 mg/L;f.兰州百合,30 mg/L;g.兰州百合,Hyg 35 mg/L;h“木门”百合,Hyg 0 mg/L;i.“木门”百合,Hyg 10 mg/L;j.“木门”百合,Hyg 15 mg/L;k.“木门”百合,Hyg 20 mg/L;l.“木门”百合,Hyg 25 mg/L;m.“木门”百合,Hyg 30 mg/L;n.“木门”百合,Hyg 35 mg/L;o.“索邦”百合,Hyg 0 mg/L;p.“索邦”百合,Hyg 10mg/L;q.“索邦”百合,Hyg 15mg/L;r.“索邦”百合,Hyg 20 mg/L;s.“索邦”百合,Hyg 25 mg/L;t.“索邦”百合,Hyg 30 mg/L;u.“索邦”百合,Hyg 35 mg/L

图6 不同浓度的潮霉素对百合鳞片再生的影响

潮霉素(Hyg)是常用于单子叶植物的选择标记[7]，本研究结果表明，当Hyg浓度为25 mg/L 时，兰州百合可产生少量不定芽并分化成苗，鳞片再生率为20%，低于这一浓度，形成的再生苗数量过多，达不到筛选目的；而高于这一浓度，鳞片再生率骤降为0。当Hyg浓度为30 mg/L 时，“木门”和“索邦”可形成较多突起，但只有少量分化成苗，再生率分别为10.5%和12.5%；低于该浓度再生苗数量过高，部分未转化细胞易分化形成植株，无法达到筛选的目的；而高于该浓度，褐变死亡鳞片数显著增加且转化植株易受Hyg毒害致死，抑制了转化细胞的正常生长。所以，25 mg/L Hyg对兰州百合抗性植株的的筛选最为适宜，“木门”和“索邦”则以35 mg/L Hyg为最适宜筛选浓度。此结果与储俊等[4]、王爱菊等[8]及梁慧敏等[9]的研究结果不同。王爱菊等[8]认为筛选最适宜的Hyg浓度为40 mg/L ，储俊等[4]则认为筛选最适宜的Hyg浓度为50 mg/L ，梁慧敏等[9]则认为10 mg/L为最适宜筛选浓度。这种试验结果的差异可能是由于不同百合属植物对Hyg的耐受能力的强弱不同所致。

图7 鳞片再生频率随潮霉素浓度的变化

图8 褐变死亡鳞片数随潮霉素浓度的变化