裸鼠皮下移植瘤及其血清DcR3表达与肿瘤大小相关性分析

李敬瑜 万光升 张淑华 彭卓龙（通讯作者）

（1开平市中心医院 广东 开平 529300）

（2上海中医药大学附属普陀医院 上海 200333）

（3南方医科大学南方医院增城分院 广东 广州 511300）

（4中国中医科学院 北京 100700）

大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤。最新数据显示肠癌已经成为我国第三大高发恶性肿瘤[1]。根治性切除术是目前唯一可能治愈大肠癌的疗法，但临床上有许多患者由于各种原因未能行根治术。为此，对患者进行系统全面的检查，以求制定合理的姑息治疗策略显得尤为重要。Liang QL等[2]发现大肠癌组织DcR3的表达与细胞分化、淋巴结转移、病理分期等存在相关性。Zong L等[3]进一步发现大肠癌组织中DcR3过表达可作为患者预后较差的标志物。然而，癌组织DcR3含量与瘤体大小的相关性，以及血清DcR3含量的意义，目前尚未有相关报道。鉴于此，本实验进行癌组织和血清DcR3与肿瘤大小的相关性研究，以期为日后的进一步临床研究提供必要的实验依据。

1.资料与方法

1.1 材料及动物

人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR，购于南京购于南京凯基生物科技发展有限公司，检测该细胞的多重耐药性，对至少三种不同的化疗药物产生耐药性。细胞培养液、血清、胰蛋白酶等试剂购于美国Gibco公司，SPF级BALB/c裸小鼠，平均每只20g左右，雌雄各半，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司（许可证号为scxk (沪)：2012-0016）。人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR所需的培养液为RPMI-1640培养液（含有青霉素100 U/ml、链霉素链霉素100μg/ml、长春新碱浓度为2g/L、10%胎牛血清的），生长环境为5% CO2培养箱，37℃培养。中药复方健脾解毒方，组成为：生黄芪、生白术、党参、猪苓、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、红藤，含生药浓度为1.46g/ml，由上海中医药大学附属普陀医院监制。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 HCT8/VCR细胞生长在上述浓度的培养液中，稳定传代。取处于对数生长期的细胞，常规胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。用生理盐水重悬细胞，计数调整细胞浓度为1×107/ml。

1.2.2细胞的接种 接种方法参考《细胞培养》[4]，将上述悬浮的细胞快速接种于4-6周龄BALB/c裸鼠右侧腋下。接种之前常规酒精消毒，用1ml微量注射器及23号针头吸取人大肠癌耐药细胞株HCT8/V单细胞悬液，确定针头位于裸鼠右侧近前肢皮下后，注入0.2m1制备好的单细胞悬液，细胞数约为2×106个，共接种10只裸鼠。

1.2.3观察 将接种后的裸鼠继续在SPF级隔离笼内生长，每日可见裸鼠接种部位逐渐长大，观察至30天时，共有7只裸鼠成瘤，裸鼠皮下肿瘤大小约为0.5～2.6cm。

1.2.4酶联免疫吸附试验 将上述生长大小不一的裸鼠测量异位移植瘤大小，脱颈处死，取瘤，称重，摘眼球取血。取血后室温静置2小时，离心（15min，3000r/min）分离血清，每只裸鼠约可取出60～150ul淡黄色血清。ELISA法检测7只裸鼠DcR3的表达水平，严格按照试剂说明书进行。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 各组裸鼠大小及重量、血清组织DcR3表达见表。

2.2 异位移植瘤的重量与血清及组织的DcR3相关性分析

表 裸鼠大小质量与血清组织DcR3表达

多药耐药裸鼠异位移植瘤组织与裸鼠血清的DcR3存在一定的相关性，移植瘤大小越大，其DcR3的表达越高，仅第三组异位移植瘤重量与组织中DcR3表达存在一定差异，这可能与该裸鼠组织坏死程度高有一定关系。

3.讨论

诱骗受体3（DcR3）是近些年新发现的肿瘤坏死因子受体超家族成员。DcR-3编码基因定位于人染色体20q13.3，它和另外3个基因共同构成基因簇，它与肿瘤的发生密切相关。据研究[5]，DcR3可通过介导LIGHT途径、TLIA途径、Fas/FasL途径的免疫细胞毒性作用，阻断细胞细胞凋亡，导致肿瘤细胞清除减少，诱导免疫耐受。临床证据[2]也显示，DcR3在人体组织中的信使阳性表达率显著高于癌旁组织，并有望成为新的肿瘤标志物，运用于肿瘤的鉴别诊断。但考虑到组织DcR3获取途径仅能通过活检，临床上难以重复多次检查以动态观察，这大大限制了DcR3的临床运用。为此，本研究从无胸腺的裸鼠入手，排除肿瘤免疫对实验的影响，并分析了肿瘤大小与癌组织、血清中DcR3之间的关系，初步分析了肿瘤的大小与DcR3的相关性，为日后进一步的血清DcR3临床研究提供必需的实验依据。此外，本研究的第三组中组织DcR3存在一定的差异，可能与肿瘤的坏死程度关系密切，后续可进一步分析DcR3与肿瘤坏死程度的关系，并拟从进一步分析DcR3与细胞凋亡的相关性及凋亡通路，为临床上进一步诊断治疗提供实验依据。