毛细管电泳测定尿液中7种核苷含量

曹志龙

（武警兵团总队医院 新疆 乌鲁木齐 830011）

核苷，作为维持细胞生命活动所需的基本物质是核酸的主要组分，核苷及其衍生物均具有显著的生理功能[1]，机体中除含有基本的正常代谢核苷（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶）外，还有大量修饰核苷，包括次黄嘌呤、假尿核苷等。修饰核苷[2-3]是正常核苷在机体内特异酶作用下生成的不易被磷酸酯化的产物。修饰核苷十分稳定，在尿中可以被定量排泄，因此尿中修饰核苷的排泄往往反映了机体RNA降解速率。正常人核苷排放浓度差异很小，但当机体发生病理性变化如细胞癌变时，核糖核酸周转会加快，尿液中各种修饰核苷的含量相应增加，因此定量快速分析各种核苷类成分的含量可以对癌症的发病进行诊断[4-6]。

高效液相色谱技术是最常见的分析尿中核苷的分析方法。蒋玉萍[7]等采用反相高效液相色谱法分别对宫颈癌、卵巢腺癌、卵巢胚胎癌患者尿中假尿核苷的水平进行测定，结果显示尿中假尿核苷可以作为区分良性、恶性卵巢肿瘤的重要标志物。近年来，高效毛细管电泳分析技术由于有着分离效率高、分析时间短、样品用量少、自动化程度高等优点已被广泛应用于尿液、中药等物质中核苷类化合物的分析[8-10]。

本文采用高效毛细管电泳法对尿液中7种核苷类成分进行定性定量分析，希望建立一种快速检测尿液中核苷的分析方法，为癌症患者的早期确诊及于临床监测提供数据支持。

1.仪器与材料

1.1 仪器

Beckman P/ACE MDQ型高效毛细管电泳仪,配二极管阵列检测器(DAD)及32Karat软件控制仪器操作（美国）；雷磁PHS-2F型酸度计(上海精科公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；Mettler Toledo十万分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，SIGMA2-16K型离心机。

1.2 材料

对照品：胸苷(Thymidine 批号：1001419412)、尿苷 (uridine批号：10002581110)，鸟嘌呤 (uracil，批号10002541230)，次黄嘌呤(hypoxanthine批号1001392974），鸟苷 (guanosine批号1001229937)，胸腺嘧啶(thymine 批号1012253008)，腺苷（adenosine批号：10001235421）以上对照品均购自SIGMAALDRICH公司（纯度均大于98%）。硼砂，氢氧化钠，磷酸二氢钠，无水乙醇，以上试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水(Millipore)。

健康志愿者尿样： 由新疆医科大学第三附属医院提供。

2.方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

用十万分之一分析天平分别精密称取放置于干燥器中的鸟嘌呤，胸苷，胸腺嘧啶、鸟苷、次黄嘌呤、腺苷、尿苷10mg，置10mL容量瓶中加水超声溶解并定容，摇匀得各对照品储备液。精密吸取各储备溶液适量至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成7种对照品质量浓度为100μg/mL混合对照品溶液。

2.2 样品处理

收集受试者24h尿样5mL，立刻放入-20℃的冰箱中冻存。测定前于室温下溶解后，精密移取200μL至于超滤离心管中，使用低温离心机12000r•min-1，4℃离心15min，将上清液转出，作为供试品溶液备用。

2.3 电泳条件

未涂层标准熔融石英毛细管(75μm×64.5cm，有效长度56cm；检测波长254nm；压力进样5kPa，5s；电压20kV；毛细管温度25℃；运行缓冲液：100mmol•L硼砂（Ph9.36）；毛细管使用前以0.1mol/L盐酸，蒸馏水，0.1moL/L氢氧化钠溶液、蒸馏水和运行缓冲液依次通过压力冲洗3min，上述试剂使用前均经 0.45μm微孔滤膜滤过，并超声脱气。

2.4 样品中各核苷峰的确定

将尿样中未知峰的迁移时间与混标中各核苷组分的迁移时间做对照，并将单个核苷组分的标准溶液分别加入到尿样中对比峰面积的变化用于定性。

2.5 标准曲线定量、检测限与定量限

精密吸取混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于 10mL量瓶中用水定容至刻度，将稀释好的不同浓度的混合标准溶液进样分析，建立核苷浓度与峰面积的标准曲线，线性回归方程及相关系数见表1，色谱图见图1。

表1 7种核苷对照品标准曲线、检测限

2.6 精密度、稳定性实验

取固定浓度的混合标准品溶液，重复进样5次，分别测得7种指标性核苷成分峰面积的RSD值，考察精密度，结果见表2，由表2见相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

取尿液样品，分别在0，2，4，8，12h进样5次，测得7种核苷成分相对峰面积的RSD均5.0%，表明稳定性良好，见表3。

表2 混合标准品中7 种核苷精密度实验

表3 样品中7 种核苷稳定性实验

2.7 加样回收率实验

精密移取已知浓度的尿液样品，加入一定浓度的对照品溶液，按“2.3”项下供试品液制备方法制备加样回收供试品溶液，并按照样品测定方法进样分析，计算回收率，见表4。

表4 加样回收率

2.8 样品分析

将供试品液按照“2.3”电泳条件下，进样分析。根据7种成分的线性回归方程计算尿液中胸苷，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，腺苷，次黄嘌呤，鸟苷，尿苷7种核苷的含量，见表5。

表5 尿液中核苷含量

3.讨论

由于核苷在pH接近中性时是不带电的，因此本次试验选择在碱性条件下对核苷进行分离，本实验采用硼砂作为电泳分离的缓冲液体系。配制了不同浓度的硼砂缓冲溶液，考察浓度对分离的影响。结果表明：当硼砂浓度为20mmol/L～100mmol/L时，被分析物能得到基本分离，虽然迁移时间会随着硼砂浓度的增高而延长，但分离度会逐渐改善，最终实验选择100mmol/L的硼砂作为分离体系。

pH会影响带电组分迁移的速度及电渗流的大小，从而影响被测物的迁移时间及分离度。在硼砂缓冲体系中考察了pH9.0～10.0的范围，结果显示，在pH9.36条件下各组分能得到基线分离，因此最终选择9.36作为最佳条件。

电压对被分析物的迁移时间及分离度的影响很大，是～个重要的参数。电压升高时，被测物迁移速度变快，从而迁移时间缩短，可节省时问，利于快速分离。但当电压增加到一定程度时，则被测物的分离度会下降，基线会出现漂移。通过实验考察，最终选择的工作电压为20kV，在此电压下，核苷的分离效果良好。

尿液中核苷的测定被认为是评价肿瘤患者病程轻重的重要指标。目前文献报道的方法多为高效液相色谱法，样品制备需要经过过滤，离心，调节pH甚至富集等多个环节，这种处理方法可能造成待测物质丢失或引入新的污染物质，且回收率低。本实验采用样品直接经超滤离心管低温高速离心后，直接进样分析测定，方法学验证显示此方法精密度、稳定性、回收率均符合要求，具有简单、快速的特点，采用生物样本尿液进行测定可以对尿液中7种核苷进行定量计算，用在临床标本检测中。但是由于尿液中7种核苷成分含量差异显著，因此有个别核苷测定值超出了线性范围，应该在后续的研究中重点讨论。