饲料添加海水螺旋藻对凡纳滨对虾生长、营养和相关免疫因子的影响

杨冰洁 李 涛 吴华莲 向文洲 段元慧 吴后波*

（1.中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东广州510301；2.中国科学院大学，北京100049；3.南方海洋科学与工程广东省实验室，广东广州510301；4.广东海大集团股份有限公司 农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室，广东广州511400）

螺旋藻营养丰富且均衡、蛋白质含量高（超过干重的50%）、且富含水产动物生长所需的维生素、矿物质、多不饱和脂肪酸和必需氨基酸等[1-3]，可作为一种良好的饲料添加剂应用于畜禽养殖和水产养殖中，但目前有关螺旋藻在饲料中的研究大部分都集中在淡水螺旋藻。与淡水螺旋藻相比，海水培养螺旋藻中的有效成分含量显著提高，如藻蓝蛋白、肌醇、可溶性多糖和各种微量元素等[4]，并且利用天然海水养殖螺旋藻能有效避免螺旋藻中重金属离子富集与超标，同时可以大幅度降低培养成本。而有关海水螺旋藻作为饲料添加剂的研究并不多见，其研究范围也仅包括有限的几个种类，如在畜禽养殖中，饲料中添加海水螺旋藻可改善猪的生长性能和肌肉品质，并对仔猪的腹泻有一定的治疗作用[5]；不同添加量的海水螺旋藻对乌鬃鹅的生长指标和全净膛率均有显著性影响，并能提高肌肉蛋白质品质[6]，还能降低乌鬃鹅的肝脏毒性和总胆固醇含量，并在一定程度上提高免疫器官指数和血清总蛋白含量[7]。在水产养殖中，适量的海水螺旋藻能明显促进彭泽鲫和改良鲫的生长并提高其肌肉营养品质[8-9]，能改善长臀鮠抗氧化和脂代谢水平[10]。因此，作为一种潜在的优质水产与畜禽动物饲料添加剂，海水螺旋藻具有良好的应用前景，扩大其研究范围，将有助于水产和畜禽动物养殖与海水螺旋藻产业的发展。

凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）（俗称南美白对虾）肉质鲜美，营养丰富，是亚洲最受欢迎的对虾养殖品种之一，也是我国目前虾类的主要养殖品种[11]。但近些年随着集约化养殖量的不断增加，在养殖过程中出现了各种问题，如种质退化、病害等，给生产带来了巨大损失[12]，而养殖病害的控制导致抗生素的大量使用，发展无抗养殖是今后饲料添加剂发展的重点方向。因此，通过饲料添加来提高凡纳滨对虾的非特异性免疫能力，提高其抗病性，已成为科研工作者的研究重点，已有大量关于凡纳滨对虾饲料添加剂的报道，如微生态制剂、中草药等，均能明显增强凡纳滨对虾的抗氧化和免疫防御能力[13-14]，但有关微藻如海水螺旋藻等作为饲料添加剂对凡纳滨对虾的免疫影响的作用却鲜有报道。

作为一种优质的畜禽和水产动物饲料添加剂，海水螺旋藻可以促进动物的生长、提高肌肉品质，并能增强动物的机体免疫力，但是目前海水螺旋藻作为饲料添加剂的应用还停留在比较初步的阶段，需更多的研究进一步探索。本研究以凡纳滨对虾为研究对象，旨在探究海水螺旋藻对凡纳滨对虾生长、营养成分和主要非特异性免疫能力的影响，为海水螺旋藻作为动物饲料添加剂的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 海水螺旋藻藻粉及饲料制作

1.1.1 藻种

本试验中所用海水螺旋藻藻种为钝顶螺旋藻SCSIO-45824 藻株，由中国科学院南海海洋研究所经济微藻种质库提供。

1.1.2 培养方法

SCSIO-45824 海水螺旋藻的培养采用修改后的南海-II号培养基[15]，培养基采用100%天然海水配置，在300 m2的跑道池进行，所用海水从试验基地附近海域抽取，通过覆盖颗粒活性炭的砂滤池过滤。跑道池培养中的叶轮搅拌转速为13 r/min，藻液流速为0.3 m/s；培养物深度保持在20 cm左右。

1.1.3 户外螺旋藻的采收与藻粉制作

当螺旋藻培养至光密度（OD700）为1.2～1.5时进行采收，采收时利用300目尼龙筛绢过滤，过滤物利用清水冲洗至少3遍去除各种无机盐成分，将采收后的藻泥铺开，晒干后将其碾碎为粉末状，室温密封保存备用。

1.1.4 饲料制作

饲料配方及营养水平见表1，对虾基础饲料由豆粕、鱼粉、面粉、虾粉、鱼油、花生麸、磷脂油等组成。将上述制作的海水螺旋藻粉按重量百分比0%（对照）、0.7%、2.1%、3.5%和5.0%添加于对虾基础饲料中，混匀后，制成粒径为1.5 mm 的颗粒。自然晾干，室温保存备用。

表1 凡纳滨对虾饲料配方及营养水平(%)

1.2 养殖管理

试验虾苗由广东海大集团提供，平均体重约为1.10 g，选择体质健壮、规格整齐的1 260尾试验虾，随机分组进行养殖试验。试验共设7组（不同海水螺旋藻比例），每组3个重复，每个重复60尾虾。试验在室内反复循环流水式玻璃水族箱养殖系统中进行。水族箱体积300 L，溶氧浓度控制在6 mg/l，温度为25～28 ℃。试验开始前，对虾苗先在水族箱中以基础饲料培养适应14 d，每天投喂2次（上午9:00和下午15:00），养殖周期为56 d。

1.3 样本收集与测定

1.3.1 样本收集

试验结束时一次性收集每个水族箱的对虾，称重并记录试验数据。每组取20 尾对虾解剖得到肝胰腺，称重后迅速放入-20 ℃冷冻保存，用于碱性磷酸酶（APK）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）等指标的测定，另外每组取15尾虾肌肉用于营养成分的分析。

1.3.2 测定方法

采用GB 5009.3—2010烘干法测定肌肉样品的水分，采用GB 6432—86微量凯氏定氮法测定肌肉样品的粗蛋白质，粗脂肪含量采用索氏抽提法，二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量利用气相色谱仪测定[16]。凡纳滨对虾肝胰腺中蛋白质含量、碱性磷酸酶（APK）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LYZ）和酚氧化酶（PO）的活力测定，均采用南京建成生物技术有限公司的试剂盒进行。

1.4 数据统计

本试验数据统计使用Graphpad Prism 5.0 软件，用One-way ANOVA 分析，选用Duncan's 法进行多重比较，进行单因素方差分析，所有数据用“平均值±标准误差”表示，P＜0.05表示差异性显著。

2 结果

2.1 海水螺旋藻对凡纳滨对虾生长性能的影响

凡纳滨对虾的生长性能如表2 所示。与对照组相比，5.0%组可以提高对虾的重量，与对照组相比终重提高12.07%（P＜0.05），然而其余各组凡纳滨对虾的终重和增重无明显提升效果，各组对饲料系数并没有显著性影响（P＞0.05）。

表2 海水螺旋藻对凡纳滨对虾生长性能的影响

2.2 海水螺旋藻对凡纳滨对虾肌肉营养成分的影响

凡纳滨对虾肌肉的营养成分见表3。与对照组相比，饲料中添加海水螺旋藻对凡纳滨对虾肌肉中的水分含量无明显影响（P＞0.05）；能够显著提高肌肉中粗蛋白的含量，分别提高了10.11%（P＜0.05）、7.40%（P＜0.05）、8.59%（P＜0.05）和10.90%（P＜0.05）；随着海水螺旋藻添加量比例的增加，肌肉中粗脂肪含量呈下降趋势，但差异不显著(P＞0.05)；各试验组中DHA含量均有所提高，其中，提高最明显的为5.0%比例添加组，提高了71.43%(P＜0.05)；试验组EPA含量也均有所提高，其中5.0%比例添加组提高最明显，提高了60.0%(P＜0.05)。

表3 海水螺旋藻对凡纳滨对虾肌肉营养成分的影响(%)

2.3 海水螺旋藻对凡纳滨对虾免疫因子的影响

2.3.1 海水螺旋藻对凡纳滨对虾碱性磷酸酶（AKP）活力的影响

海水螺旋藻对凡纳滨对虾肝胰脏碱性磷酸酶（AKP）的影响如图1。与对照组相比，0.7%、2.1%、3.5%和5.0%各组中AKP活力随海水螺旋藻比例的增加而增加，其中5.0%组中AKP 活力显著提高，提高31.98%（P＜0.05）。

图1 不同水平的海水螺旋藻对凡纳滨对虾AKP活力的影响

2.3.2 海水螺旋藻对凡纳滨对虾溶菌酶(LYZ)活力的影响

海水螺旋藻对凡纳滨对虾肝胰脏溶菌酶（LYZ）活力的影响如图2 所示。与对照组相比，2.1%、3.5%和5.0%组中LYZ活力显著提高，分别提高了147.47%（P＜0.05）、139.39%（P＜0.05）和137.37%（P＜0.05）。各组中LYZ活力随海水螺旋藻添加量的增加而增加，至添加量为2.1%时达到最大值2.45 U/mg prot.，之后活力随海水螺旋藻添加量的增加而略有降低。

2.3.3 海水螺旋藻对凡纳滨对虾酚氧化酶（PO）活力的影响

海水螺旋藻对凡纳滨对虾肝胰脏酚氧化酶（PO）活力的影响如图3 所示。与对照组相比，0.7%、2.1%和5.0%组中PO 活力显著提高，分别提高了35.36%（P＜0.05）、21.79%（P＜0.05）和31.78%（P＜0.05）。

图2 不同水平的海水螺旋藻对凡纳滨对虾LYZ活力的影响

图3 不同水平的海水螺旋藻对凡纳滨对虾PO活力的影响

2.3.4 海水螺旋藻对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶活力（SOD）的影响

海水螺旋藻对凡纳滨对虾肝胰脏超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响如图4 所示。与对照组相比，0.7%和3.5%组中SOD 活力显著提高，分别提高了27.49%（P＜0.05）和28.57%（P＜0.05）。

2.3.5 海水螺旋藻对凡纳滨对虾谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响

海水螺旋藻对凡纳滨对虾肝胰脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响如图5 所示。与对照组相比，0.7%组和3.5%组中GSH-Px 活力显著提高，分别提高了10.81%（P＜0.05）和8.04%（P＜0.05），5.0%组中GSH-Px活力显著降低，降低了10.46%（P＜0.05）。

图4 不同水平的海水螺旋藻对凡纳滨对虾SOD活力的影响

图5 不同水平的海水螺旋藻对凡纳滨对虾GSH-Px活力的影响

3 讨论

3.1 饲料中添加海水螺旋藻对凡纳滨对虾生长性能的影响

本研究表明，饲料中海水螺旋藻添加量为0.7%～3.5%时对凡纳滨对虾的生长均有一定幅度的提高，但统计学上没有显著性差异（P＞0.05），高含量添加海水螺旋藻（0.5%）能显著性促进凡纳滨对虾的生长（P＜0.05）。郑献昌等[17]证明饲料中淡水螺旋藻添加水平对南美白对虾生长性能无明显地改善，表明海水螺旋藻具有更高的应用前景。张华等[18]研究表明，饲料中添加适量螺旋藻能提高脊尾白虾存活率、特定生长率和吸收效率，虞为等[19]试验表明，饲料中添加螺旋藻可显著提高花鲈特定生长率和增重率，并显著降低饲料系数。出现这种现象的原因可能是不同的养殖品种具有不同的营养需求。

3.2 饲料中添加海水螺旋藻对凡纳滨对虾肌肉营养成分的影响

螺旋藻的蛋白质水平与肉类和大豆相似，除此之外它含有大量的维生素、矿物质、酚类、必需脂肪酸、氨基酸和色素，因此，对水生动物的营养价值极高[20]。在本试验中，海水螺旋藻的添加对凡纳滨对虾肌肉中的水分含量没有显著影响，与对照组相比，各海水螺旋藻添加组中粗蛋白含量有显著性提高，海水螺旋藻不同百分比添加量各组间没有显著性差异。不同海水螺旋藻添加水平投喂凡纳滨对虾，对凡纳滨对虾肌肉中粗脂肪含量没有显著性影响。与对照组相比，5.0%组DHA 和EPA 含量显著性提高（P＜0.05），其他各试验组DHA和EPA含量也有一定程度的提高。该试验结果与刘立鹤等[21]的试验结果大致相似，因此提高凡纳滨对虾蛋白含量仅需添加低比例的海水螺旋藻即可。操玉涛等[22]研究结果说明饲料中适量添加淡水螺旋藻可以显著提高凡纳滨对虾EPA 和DHA 的含量，最适添加量为1.5%。本试验中海水螺旋藻各添加组对DHA 和EPA 含量均有提高，添加量在5.0%时DHA 和EPA 的含量达到最高。螺旋藻并不能合成EPA和DHA，而饲料中添加螺旋藻使凡纳滨对虾肌肉中EPA 和DHA 含量提高，说明螺旋藻并不是EPA 和DHA 的直接来源，基础饲料中的鱼粉、鱼油、磷脂油等是EPA 和DHA 的直接来源，可能是由于螺旋藻中某些活性因子有助凡纳滨对虾DHA 和EPA 的合成转化或积累。

3.3 饲料中添加海水螺旋藻对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响

凡纳滨对虾为低等的无脊椎甲壳动物，肝胰腺参与体内代谢、解毒和排泄等生理过程[23]，是一个非常重要的器官[24]，虾体内没有特异性免疫系统，主要依靠非特异性免疫抵抗病原体入侵，体内抗微生物因子主要是包括各种水解酶，如酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶等[25-26]。在本试验中，饲料中添加海水螺旋藻后，除0.7%组外，其余各组中碱性磷酸酶活力均有不同程度的升高，并呈现上升趋势；各试验组中溶菌酶活力随海水螺旋藻添加量的增加而增加，至添加量为2.1%时达到最大值，之后活力随海水螺旋藻添加量的增加而略有降低，其中2.1%、3.5%组和5.0%组活力显著提高（P＜0.05）；除5.0%组中谷胱甘肽过氧化物酶活性显著性降低（P＜0.05）之外，各组中酚氧化酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均有一定程度的提高。几种抗氧化酶的活力与螺旋藻添加剂量所呈现的规律性不强，特别是偶有出现海水螺旋藻高剂量添加下的活力降低，其主要原因可能是海水螺旋藻富含藻蓝蛋白、SOD、谷胱甘肽、类胡萝卜素等高活性抗氧化的活性物质，可以清除一部分由于环境应激或病变所产生的氧化胁迫因子，对相关抗氧化酶形成了一定的功能补偿机制，导致高添加剂量下不同幅度的下降。但总的来说，饲料中添加海水螺旋藻可以提高凡纳滨对虾包括抗氧化活力在内的非特异性免疫。

综上所述，海水螺旋藻添加对凡纳滨对虾非特异性免疫有提高，可以不同程度提高碱性磷酸酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力，添加不同浓度的海水螺旋藻对凡纳滨对虾的生长、品质均有不同程度的改善，综合前述各方面的数据和分析，建议在凡纳滨对虾的养殖中添加海水螺旋藻2.1%～5.0%更为有益。本研究结果还表明，鉴于海水螺旋藻对凡纳滨对虾较为显著的免疫增强和潜在的抗病害作用，有望作为无抗饲料候选添加剂，应用前景广阔，有待进一步深入探讨。

4 结论

综上所述，饲料中添加2.1%～5.0%海水螺旋藻，可促进凡纳滨对虾的生长，提高凡纳滨对虾肌肉中蛋白质、DHA和EPA含量，增强凡纳滨对虾的非特异性免疫能力，说明海水螺旋藻可作为凡纳滨对虾饲料添加剂应用于实际养殖中，具有良好的应用前景。