红曲对黄酒挥发性风味物质的影响

钟明叶，刘学彬，王久明，周子寒，陈 帅，罗爱民

(1.四川大学轻纺与食品学院，四川成都 610065；2.四川茂华食品有限公司，四川眉山 620010；3.四川宜府春酒厂有限责任公司，四川邛崃 611530)

红曲黄酒作为中国三大典型黄酒之一，是以糯米为主要原料，添加红曲、药白曲和酵母等，经多种微生物糖化发酵酿造而成[1]。由于红曲中的红曲霉菌代谢产生Monacolin K、红曲色素和γ-氨基丁酸等具有显著降血压、降血脂和降胆固醇的代谢物[2-4]，因此将红曲添加至黄酒中进行发酵，赋予黄酒以与众不同的功效，提高了其经济价值和保健价值[5-6]。红曲黄酒的风味是影响红曲黄酒的感官品质与风格的一个关键因素，特别是其中含量微少的特征性挥发性风味物质，它们的存在对红曲黄酒的风味形成有关键作用[7-8]。但是，就红曲对黄酒发酵产品中风味物质的影响，目前还没有明确研究。此外，当发酵培养基组成改变以后，红曲的糖化力、液化力和酯化力等是否会发生较大改变也尚不清楚。

无机盐可为微生物提供除碳、氮源以外的各种重要元素，在微生物的产氢过程中产生辅助的作用从而参与生理和生物化学反应[9]。有研究发现，Fe、Zn、Mg、Mn 和Cu等金属离子对真菌的生长和次级代谢产物的产生具有促进作用[10-11]。也有研究表明，在土霉菌培养基中添加Fe、Zn、Mg、Mn和Cu等金属可以有效的提高洛伐他汀的产量，对洛伐他汀生产过程中的水分、pH 值和总糖消耗以及Monacolin J转化率都有较为显著的影响[12-14]。

气相色谱（GC）技术因其具有高灵敏性和优越的分离性能的特点，被广泛使用于医学药品、天然药物、食品、化工等领域[15-21]。由于酒中的挥发性风味物质组成较为复杂，同时含量低且容易挥发，这就使得对酒中的挥发性风味物质的分析必须选用高效的现代分析仪器进行。近年来，GC 技术也广泛的应用于酒类香气物质的研究中[22-26]。本研究通过向红曲中添加金属离子筛选出糖化力和酯化力较高的品种应用于红曲黄酒的酿造，运用GC 对得到的黄酒产品的风味物质进行定性和定量分析，比较添加红曲后黄酒风味物质的变化以及分析不同发酵条件下的红曲发酵产物对黄酒风味物质的影响。为红曲黄酒酿造及提高红曲黄酒风味物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 实验材料

红曲霉（Monascus ruber），来自于四川大学轻纺与食品学院食品系生物实验室保藏。

优质粳糯米：孝感市富饶农副产品有限责任公司。

红曲发酵产物：锌离子红曲，镁离子红曲，无金属离子红曲。

斜面培养基：葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、酵母提取物0.4%、麦芽浸粉2%、琼脂2%、KH2PO40.2%、NaNO30.2%、MgSO40.1%，121 ℃灭菌20 min[14]。

种子培养基：麦芽汁15 g/L，燕麦粉5 g/L，玉米粉5 g/L，葡萄糖10 g/L。

1.1.2 实验试剂

浓硫酸、20%氢氧化钠溶液、无水乙醇溶液等一般常用化学药品均为国产分析纯；乙酸正戊酯、2-乙基正丁酸、叔戊醇均为国产色谱纯。

1.1.3 仪器设备

YXQ-LS-30SII 立式压力蒸汽灭菌锅，上海一恒实验设备有限公司；FA2004B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；DHP-600电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；MJ-250 恒温干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-ID 双人单面超净工作台，江苏净化设备公司；FW-100 高速万能粉碎机，天津杰斯特仪器有限公司；HH-4恒温水浴锅，国华电器有限公司；7890A 自动进样气相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 红曲种子液

在28 ℃下活化3 d 的斜面种子，用无菌水制成孢子数量控制在106个/mL（镜检）的孢子悬浮液。取2 mL 接种于种子培养基中，160 r/min，培养48 h。

1.2.2 红曲发酵产物

称取50 g 大米加入250 mL 锥形瓶，经过60 ℃浸泡2 h 后分别加入FeSO4、MnSO4、ZnSO4、MgSO4，高温灭菌蒸煮处理后，按照5%的比例接种摇瓶种子液，28 ℃下培养12 d 且第4 天开始定期添加一定水分保湿。第12 天，将4 种红曲发酵物在38 ℃下烘干，然后粉碎过80目筛。

1.2.3 红曲黄酒发酵

糯米浸泡在水中24 h，然后常压下清蒸0.5 h，待米饭品温降到30 ℃左右时，按米量0.4%加入安琪甜酒曲（根霉曲）与米饭拌匀、搭窝，于28 ℃保温培养。同时称取红曲发酵产物，加其10 倍左右的水浸曲2 d，待糖化48 h 左右时，按照米量的1‰分别添加活化后的酵母菌及红曲发酵产物，以料液比1∶1.8（m/v）加入灭菌后冷却至30 ℃的温开水，充分搅拌均匀，用蜡纸扎口于28 ℃生化培养箱中恒温发酵9 d，至米粒下沉。最后过滤压榨。

1.2.4 不同红曲对黄酒挥发性风味成分的影响

样品预处理：将样品置于4 ℃以10000 r/min 离心10 min 提取上清液，用0.22 μm 滤膜进行真空抽滤，得到待测样品。采用毛细管气相色谱(GC)法，氢火焰离子化检测器检测样本，以标准品保留时间定性，叔戊醇、乙酸正戊醇和2-乙基丁酸作内标定量。

气相色谱检测内标液的浓度：15 mg/100 mL的2-乙基丁酸、16.5 mg/100 mL 的乙酸正戊酯和16 mg/100 mL叔戊醇。

GC 条件：毛细管柱为ZB-Waxplux，规格为60 m，0.25 mm，涂层厚0.25 μm；载气使用氮气，流速为1 mL/min，分流比20∶1；升温程序：40 ℃，保持1 min，4 ℃/min 速度下升温至150 ℃保持10 min，以10 ℃/min 速度升温至210 ℃，保持18 min，以20 ℃/min 升温至230 ℃，保持5 min；氢火焰离子化检测器温度为250 ℃。采用气相色谱和内标法对黄酒挥发性成分进行定性和半定量分析。以2-乙基丁酸、乙酸正戊酯和叔戊醇为内标，根据Mo、FAN 所描述的方法对挥发性化合物进行了半定量测定，其公式如下[27]：

式中：C——分析物的相对浓度(mg/100 mL)；

Cis——样品中内标(IS)的最终浓度；

Ac——分析物的峰面积；

Ais——内标的峰面积。

黄酒的样品酒挥发性的香气成分检测用的是直接进样法[28]。

1.2.5 数据处理

使用SIMCA-P 11.5 对黄酒香气成分进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同红曲对黄酒挥发性风味成分总体影响分析

在实验前期根据对不同组分的红曲发酵产物进行酯化力和糖化力的测定得到对照组以及添加镁离子和锌离子组的酯化力和糖化力较高，所以将这3组的红曲产物应用于黄酒发酵。

在试验中设定H0 组表示无红曲的黄酒，H1 表示常规红曲黄酒，H2 表示锌离子红曲黄酒，H3 表示镁离子红曲黄酒。通过对样品进行离心过滤等前处理，得到待测样品，进行气相色谱法的定性和定量分析，黄酒挥发性风味成分种类和含量见表1。为能更直观地分析出红曲对黄酒挥发性风味成分的影响，将表1 中的香气成分进行归类比较，结果见图1。

图1 不同黄酒挥发性化合物的含量

4 种黄酒的挥发性风味成分鉴定结果表明，共有49 种挥发性风味成分，其中醇类13 种、酯类15种、酸类8 种、醛类7 种、酮类4 种、酚类及含氮物2种。其中有10 种是4 种黄酒共有的。由表2 可知，添加不同种类红曲的黄酒和空白黄酒之间各种挥发性成分在含量和种类之间存在明显不同，表明红曲能显著改变黄酒中的挥发性风味成分。

2.2 红曲对黄酒挥发性风味成分的分类分析

2.2.1 红曲对黄酒酯类挥发性风味成分的影响

酯类物质在酒中往往是一种很重要的呈香呈味成分。由表1 和图2 可知，无红曲组黄酒H0 和常规红曲组黄酒H1 的酒样中酯类总含量分别为3.64 mg/100 mL 和2.93 mg/100 mL，均低于金属离子红曲组黄酒，其中锌离子红曲组黄酒H2 为4.64 mg/100 mL，镁离子组黄酒H3为4.71 mg/100 mL。添加红曲的黄酒其酯类成分的种类明显多于未添加红曲黄酒。说明添加红曲不仅增加了黄酒中酯类成分含量也增加了酯类成分的复杂性。

表1 不同黄酒中挥发性化合物分析

2.2.2 红曲对黄酒醛类挥发性风味成分的影响

从表1 可知，无红曲黄酒中的醛类物质总含量明显高于红曲黄酒，主要的醛类是乙醛和异丁醛，其中异丁醛含量为2.44 mg/100 mL，而红曲黄酒中的主要醛类物质是乙醛，且红曲黄酒中都不含异丁醛。同时无红曲黄酒中的乙醛成分的含量远远高于金属离子组黄酒。上述结果表明,添加红曲能抑制黄酒中醛类物质的生成，且金属离子红曲能抑制黄酒中乙醛的产生。

2.2.3 红曲对黄酒醇类挥发性风味成分的影响

醇类是一种重要的呈味物质，中国酒中重要的醇类物质主要有多元醇和高级醇。由表1 可以看出，就总醇含量而言，无红曲组黄酒明显高于红曲组黄酒，但红曲组黄酒尤其是金属离子红曲黄酒中的醇类物质种类相对丰富。上述结果表明，添加红曲会在一定程度上降低黄酒中醇类物质的含量，不会使黄酒中的高级醇类物质含量过高，且能丰富黄酒中的醇类物质种类，从而也使得黄酒的整体风味更加醇厚丰满。

2.2.4 红曲对黄酒酮类挥发性风味成分的影响

由表1 可以发现，无红曲组黄酒几乎无酮类物质产生，而红曲组黄酒中都检测到了不同的酮类物质。对比4 组黄酒，可以发现其中无金属离子组黄酒和锌离子组都检测到3 种酮类，而添加镁离子组检测到两种酮类。其中无金属离子红曲组的酮类含量最高，为2.07 mg/100 mL。上述结果表明，红曲的添加能促进黄酒中酮类物质的产生，金属离子可能会影响红曲发挥这一作用。

2.2.5 红曲对黄酒酸类挥发性风味成分的影响

酸类在酒中往往起到协调、平衡的作用，可增加醇厚感、减少苦杂味。从表1 可以看出，4 种黄酒中共检测出8种酸，其中低碳链饱和酸7 种，长链不饱和酸1种。在8种酸中，乙酸的含量最高，其中镁离子红曲黄酒的乙酸含量高达109.22 mg/100 mL。由表1 可以发现，添加红曲后黄酒中的挥发性酸类物质总含量相对于未添加红曲黄酒有极大的提高，上述结果表明，红曲特别是金属离子红曲的添加可以丰富黄酒中挥发性酸类物质的种类和含量。

2.2.6 红曲对黄酒酚类及含氮类挥发性风味成分的影响

酚类化合物可以在酒中起到呈香作用[29]，可以有效的抗衰老及预防众多疾病的发生[30]。吡嗪类化合物是酒中的生物活性物质和重要香气成分。从表1 中可知，4 种黄酒中共检测出2 种酚类及含氮类挥发性物质，三甲基吡嗪和4-乙基苯酚。就酚类物质而言，4-乙基苯酚在无红曲黄酒中的含量最高为2.38 mg/100 mL。以上结果说明，添加红曲可能会促进黄酒中吡嗪类挥发性物质的生成，但却会抑制酚类物质的生成。

2.2.7 不同红曲黄酒的挥发性风味物质的主成分分析

图2 不同黄酒挥发性香气成分主成分分析得分载荷双标图

为探讨挥发性风味物质与不同组分的黄酒之间的联系，研究添加红曲对黄酒挥发性风味成分的影响，利用SIMCA-P 11.5 软件对4 组酒样的挥发性风味物质的测量值进行主成分分析，香气成分变量按表1 中次序依次编号得出不同黄酒及其挥发性香气成分主成分分析得分载荷双标图。由图2可以看出，不添加红曲的黄酒（H0）与添加红曲的黄酒(H1、H2、H3)分属于不同的象限，添加普通红曲的黄酒(H1)与添加金属离子红曲的黄酒(H2、H3)也分属于不同的象限，这表明H0、H1、与H2、H3 在主成分上能分开，黄酒的香气成分存在明显差异。且由图2 可知，甲醇（a1）、苯丙酸乙酯（b12）、乙酸（c1）、与主成分1 高度正相关，庚酸（c6）、癸酸（c7）、异丁酸（c3）、4-乙基苯酚（o2）、异丁醛（f3）与主成分1 高度负相关。（d3）、正丙醇（a2）、庚醇（a9）、与主成分2 高度正相关，总酯（b16）、乙酸乙酯（b2）、乙酸己酯(b6)与主成分2高度负相关。

3 结论

采用气相色谱(GC)技术，对4 种不同发酵黄酒样品中的挥发性物质进行了分离和鉴定。结果表明，添加金属离子红曲发酵的黄酒其酯类、酸类、酮类物质种类及总含量均高于对照组和无金属离子红曲发酵的黄酒，醇类、醛类、酚类及含氮物质的种类均高于对照组，总含量低于对照组和无金属离子红曲发酵的黄酒，说明金属离子红曲增加了黄酒中主要呈香类挥发性物质的种类。

本研究鉴定了49 个挥发性物质。基于不同黄酒挥发性物质的主成分分析，添加不同红曲发酵物的黄酒与空白组黄酒在挥发性成分上存在明显差异，由此可以对4 种黄酒进行鉴别，在相同的检测条件下，添加不同红曲的黄酒和不添加红曲的黄酒检测出不同的挥发性物质。加金属离子的红曲培养物能有效提高黄酒中挥发性物质的种类，增加黄酒的醇厚感，促使黄酒酒体更加丰满，促进黄酒生产向具有更加鲜明、更加富有表现力的品种特征的方向发展，这也是黄酒生产的稳定发展趋势。除了黄酒发酵工艺外，合适的酿酒微生物的选育也是影响黄酒风味的重要因素之一。红曲一直是黄酒风味物质研究领域常用的菌种制剂，本文通过添加金属离子对红曲进行优化用于黄酒发酵，结果表明，添加不同的红曲发酵物对黄酒的风味物质有明显的改善，但其中的作用机制仍有待后续研究。