不同浓度七氟烷对人骨肉瘤saos2细胞增殖、迁移的影响及机制

2020-06-05 03:24李珊珊王忠慧杨会全宇航龚玲俐
山东医药 2020年14期
关键词:氟烷抑制率划痕

李珊珊,王忠慧,杨会,全宇航,龚玲俐

云南省肿瘤医院 昆明医科大学第三附属医院,昆明650118

骨肉瘤是骨组织最常见的原发性恶性肿瘤,青少年多发。目前骨肉瘤的治疗主要是新辅助化疗和手术,5年生存率为60%~70%[1]。七氟烷是常用的吸入麻醉剂,药理研究显示,七氟烷除了具有麻醉作用外,还可以降低缺血再灌注损伤、保护重要器官功能以及减轻炎症反应、降低肺泡毛细血管通透性等[2~4]。近年研究发现,七氟烷的应用与肿瘤术后复发转移有关[5]。七氟烷对不同的肿瘤细胞的作用表现不完全一致,且不同浓度七氟烷对同种肿瘤细胞的作用也不尽相同。临床常用的七氟烷浓度为1.0%~5.1%。Argano等[6]报道,1.7%七氟烷可促进原发性犬乳腺癌细胞的增殖能力,但对转移性乳腺癌细胞则表现为浓度依赖性的抑制作用。Bundscherer等[7]报道,5.1%七氟烷可以显著抑制结肠癌细胞的生物活性。还有研究显示,3.0%七氟烷对肺腺癌A549细胞的转移潜能表现为抑制,但相同浓度的七氟烷则可促进卵巢癌的复发转移[8,9]。此外,七氟烷对白血病干/祖细胞呈浓度依赖性的抑制作用[10],而2.0%七氟烷能够明显促进神经胶质干细胞的生长[11]。2017年5月~2019年2月,我们观察了不同浓度七氟烷对人骨肉瘤saos2细胞增殖、迁移能力的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤saos2细胞由中国医学科学院医学生物学研究所提供。七氟烷由恒瑞医药有限公司提供。胎牛血清购自BIOSHARP公司,RPMI1640培养基、CCK-8试剂盒购自南京建成生物工程研究所。CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司,伤口愈合实验使用ibidi迁移插件。

1.2 细胞培养与分组 向细胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中。取对数期生长细胞,配制成1×106/mL的细胞悬液,接种于细胞培养板中,分别标记为对照组、1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组。

1.3 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。向细胞中加入0.25%胰酶消化,制备细胞悬液,按2.5×103/孔接种至96孔板内,过夜培养后,将1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组分别置于特制无菌密闭容器中,容器进气口与七氟烷麻醉机连接,出气口与气体分析仪连接。在达到相应的七氟烷浓度后,同时夹闭进气口和出气口,使细胞在七氟烷中暴露2 h。处理完毕后,从密闭容器中取出细胞继续培养24 h。对照组不进行七氟烷气体暴露,继续培养24 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂孵育2 h,上酶标仪,于450 nm波长下检测吸光度A值。细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。实验重复3次,取平均值。

1.4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。向细胞中加入0.25%胰酶消化,制备细胞悬液,调整细胞密度为2.5×104/mL。向ibidi插件的左右孔中各加入100 μL细胞悬液,培养箱内培养至融合度达90%~100%。用镊子将伤口愈合插件拔出,PBS清洗。按照1.3的方法,将1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组在不同浓度的七氟烷中暴露2 h,继续培养24 h;对照组则不进行七氟烷气体暴露,继续培养24 h。记录0、12 h伤口愈合情况。采用Image J图像分析软件计算划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。实验重复3次,取平均值。

1.5 细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blotting法检测细胞中EMT相关蛋白E型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及MAPK信号通路相关蛋白转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达。取对数生长期细胞,按1×105/孔接种于6孔板。待细胞贴壁,按照1.3的方法,将1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组在不同浓度的七氟烷中暴露2 h,对照组则不进行七氟烷气体暴露,然后在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h;取各组细胞,加入细胞裂解液提取细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE电泳液,电泳后转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭,4 ℃摇床过夜。弃封闭液,清洗,加入TBST溶液1∶1 000稀释的一抗,4 ℃孵育过夜。加入5%脱脂奶粉TBST溶液1∶2 000稀释的抗兔抗体,室温摇床2 h。TBST洗涤后,加入适量显影剂,观察图像并拍照,采用Image J软件对条带的灰度值进行分析。以GAPDH作为内参,计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 对照组、1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组的细胞增殖抑制率分别为0、9.35%±1.23%、14.36%±2.46%、19.26%±3.71%,不同浓度七氟烷组细胞增殖抑制率均高于对照组,5.1%七氟烷组增殖抑制率高于1.7%、3.4%七氟烷组,3.4%七氟烷组高于1.7%七氟烷组(P均<0.05)。

2.2 各组细胞迁移能力比较 对照组、1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组划痕愈合率分别为86.27%±4.56%、59.71%±2.34%、56.10%±2.81%、23.42%±7.13%。七氟烷组划痕愈合率低于对照组,5.1%七氟烷组划痕愈合率低于1.7%、3.4%七氟烷组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表达比较 与对照组相比,七氟烷组Ecadherin蛋白表达升高,Vimentin、TGF-β1、MMP-2表达降低(P<0.05)。5.1%七氟烷组E-cadherin蛋白表达较1.7%、3.4%七氟烷组升高,Vimentin、TGF-β1、MMP-2表达较1.7%、3.4%七氟烷组降低(P均<0.05)。1.7%七氟烷组与3.4%七氟烷组比较亦有统计学差异(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表达比较

注:与对照组比较,*P<0.05;与1.7%七氟烷组比较,#P<0.05;与3.4%七氟烷组比较,△P<0.05。

3 讨论

对于早、中期实体肿瘤,手术切除可显著延长患者寿命、提高患者生存质量,但手术及创伤也能促进新的肿瘤转移灶形成和加快微小病灶的发展。对于肿瘤手术患者而言,麻醉方式及方法的不同可能会影响肿瘤生长,一定程度上也影响到患者预后。七氟烷因其诱导迅速、可控性高等优点而广泛用于手术麻醉。有研究证实,七氟烷除麻醉作用外,还可通过减少心肌细胞、神经元或肾小管上皮细胞凋亡,对心、脑、肺、肾等重要器官的缺血再灌注损伤具有保护作用,从而降低宿主器官损伤。七氟烷影响肿瘤生长的可能机制主要包括血小板活化[12]、诱导凋亡小体产生[13]以及Ras/ERK、TGF/Smad3和PI3K/AKT等信号通路的激活[14]等。

多项体外细胞实验和动物实验表明,七氟烷可通过多种机制促进或抑制肿瘤增殖。本研究结果显示,不同浓度七氟烷组细胞增殖抑制率均高于对照组,以5.1%七氟烷的抑制作用最强,3.4%七氟烷组次之。表明不同浓度的七氟烷均能够抑制saos2细胞增殖,且浓度越高,作用越强。Ciechanowicz等[15]报道,肺癌A549细胞在3.6%七氟烷暴露2 h后,其增殖活力受到明显抑制,同时还能增加顺铂化疗敏感性,其机制与上调TGF-β1信号通路中的下游分子Smad3的核内水平有关;但相同浓度的七氟烷在肾癌Rcc4细胞中的作用相反,可使Rcc4细胞增殖增强,促进肾癌转移的潜能。本研究结果显示,1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能降低saos2细胞TGF-β1表达,从而达到抑制其恶性潜能的作用。

肿瘤的转移能力与肿瘤细胞的迁移能力密切相关。本研究结果显示,不同浓度七氟烷组划痕愈合率均低于对照组,5.1%七氟烷组低于1.7%、3.4%七氟烷组,表明1.7%、3.4%、5.1%七氟烷均能够抑制saos2细胞迁移,而5.1%七氟烷的抑制作用最强。Fan等[16]报道,1%~4%七氟烷均能够抑制结直肠癌SW620细胞和HCT116细胞的侵袭和迁移能力,其机制是通过上调miR-203而起到调节ERK/MMP-9信号通路的作用。本研究中也同样验证了七氟烷对骨肉瘤saos2细胞中MMP家族中的MMP-2有抑制作用。

EMT是肿瘤侵袭、转移过程及肿瘤产生耐药性的关键步骤,肿瘤的恶性程度直接由肿瘤细胞EMT的程度所决定[17]。E-cadherin是一种细胞膜黏附蛋白,当恶性肿瘤细胞E-cadherin蛋白表达下调时,细胞极性会消失,从而使肿瘤细胞获得侵袭转移的能力;当肿瘤细胞Vimentin蛋白表达上调时,则提示其由上皮细胞表型转变为间质细胞表型[18]。本研究结果显示,不同浓度七氟烷处理saos2细胞后,E-cadherin蛋白上调、Vimentin蛋白下调,表明七氟烷能有效抑制saos2细胞EMT相关蛋白表达。

综上所述,1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能够抑制人骨肉瘤saos2细胞的增殖和迁移能力,其中以5.1%七氟烷作用最强;其机制可能与抑制细胞EMT以及下调MAPK信号通路活性有关。但体外细胞实验与临床实际存在很大差距,关于七氟烷对人体骨肉瘤的影响仍需动物实验和临床研究进一步阐明。

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