TLR4/PI3K信号通路对脂多糖诱导人冠状动脉内皮细胞缝隙连接蛋白43 mRNA表达的影响

李明远 巫相宏 闭奇 文伟明 郑鹏飞 吴成 窦慧 陈基源

【摘要】目的 探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的特异性抑制剂（LY294002，LY）通过Toll样受体4（TLR4）相关的PI3K信号通路对脂多糖主要活性成分Kdo2 -lipid A（KLA）诱导人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）中TLR4、PI3K及缝隙连接蛋白43（Cx43）mRNA表达的影响及其可能的机制。方法 体外培养HCAEC，将HCAEC随机分为Con组（空白对照组）、KLA组（0.05 mg/L）、LY组（2.5 ?M）、LY+KLA组（LY 2.5 ?M+KLA 0.05 mg/L），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测以上分组中TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达量改变。结果 与Con组相比，KLA组TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），LY组PI3K mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与KLA组相比，KLA+LY组TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 KLA刺激促进HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达增加，LY294002通过部分或全部抑制由TLR4/PI3K信号通路减少KLA刺激的HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达，保护Cx43的正常生理功能发挥抗炎作用抵抗动脉粥样硬化。

【关键词】Toll样受体4;磷脂酰肌醇3-激酶;缝隙连接蛋白43;人冠状动脉内皮细胞

【中图分类号】R543.5 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.4..02

THE regulation of TLR4/PI3K signaling pathway on KLA-mediated

Connexins43 expression in human coronary endothelial cells

LI  Ming-yuam， WU  Xiang-hong*， BI  Qi， WEN  Wei-ming，

ZHENG  Peng-fei， WU  Cheng， DOU  Hui， CHEN  Ji-yuan

（Department of cardiovascular medicine， the First Affiliated Hospital

of Guangxi Medical University，Guangxi Nanning 530021，China）

【Abstract】Objective To investigate the role of LY294002 in Kdo2 -lipid A（KLA）-mediated TLR4、PI3K、Cx43 expression in human coronary endothelial cells（HACEC）.Methods TLR4、PI3K and Cx43 expression was detected by RT-PCR in HCAEC after 24h treatment.Results Compared with the control group，the expression of TLR4、PI3K and Cx43 was up-regulated in the KLA group（P<0.05），while PI3K was down-regulated in the LY group（P<0.05）.Furthermore，Compared with the KLA group， the expression of TLR4、PI3K and Cx43 was significant down-regulated when co-treatment with LY and KLA（P<0.05）.Conclusion LY294002 protected the normal physiological functions of Cx43 and exerting anti-inflammatory effects to fight atherosclerosis.

【Key words】Toll-like Receptor4;Phosphoinositide3-Kinase;Connexins43;Human Coronary Artery Endothelial Cell

動脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是威胁人类健康的多种心血管疾病共同的病理生理基础，其特点是以内皮细胞功能障碍和炎症因子等不断在动脉壁造成损伤的慢性炎症反应。人的心脏组织中存在TLR4受体，TLR4受体激活使胞外信号得以转导到胞内，TLR4受体与机体应激、炎症、损伤、坏死密切相关[1] KLA是脂多糖（LPS）的主要活性部位，是一种强烈的炎症启动因子，可通过TLR4受体导致炎症反应的发生。PI3K信号通路对细胞生存、增殖、分化、凋亡的功能起到非常重要的调控作用[2]。Cx43是介导细胞间小分子物质和信号的传递的主要蛋白，Cx43对内皮细胞的正常生理功能有重要调控作用。鉴于此，本实验旨在观察PI3K特异性抑制剂LY294002对KLA刺激的HCAEC 中TLR4、PI3K及CX43 mRNA表达量的影响，探讨LY294002对冠状动脉内皮细胞缝隙连接蛋白功能的影响及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及材料

HCAEC细胞株、内皮细胞培养基（ECM）购自美国Sciencell公司，KLA购自美国Avanti Polar Lipids公司，LY294002购自美国CST公司， RNA提取试剂盒购自日本TAKARA公司，引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将HCAEC种植于含4mLECM完全培养基的25 cm2培养瓶内，置于培养箱内培养，培养条件为37℃、5%CO2，新植入的冠脉内皮细胞隔天换液，视生长情况以后48～72 h换液，待培养瓶中细胞生长至90%密度左右即可传代。

1.2.2 实验分组

将HCAEC分为以下4组：空白对照组（Con组）、KLA组（0.01 mg/L）、LY组（2.5 ?M）、LY+KLA组（LY2.5 ?M+KLA0.01 mg/L）。

1.3 RT-PCR法检测

采用PCR法检测各组HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA表达水平，应用ABI Prism 7500序列检测系统进行PCR反应。以各组GADPH扩增产物为内参照，用2△△CT法计算各组TLR4、PI3K、Cx43 mRNA相对表达量。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，其中两组间的比较采用SNK检验，当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

RT-PCR法检测各组冠状动脉内皮细胞中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA相对表达量：结果显示，与Con组比较，KLA组TLR4、PI3k、Cx43 的mRNA表达量显著上升，差异有统计学意义（P<0.05），LY组PI3K表达量显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与KLA组比较，KLA+LY组TLR4、PI3k、Cx43 的mRNA表达量显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），見表1。

3 讨 论

动脉粥样硬化的形成与血管内皮损伤、平滑肌迁移、脂质浸润及血管持续性的慢性临床炎症反应息息相关[3]，抗炎的失衡可能是动脉粥样硬化发生与进展的关键所在。TLR4信号通路通过多个途径参与动脉粥样硬化的起始和进展及一系列AS相关的细胞因子、炎症因子的合成与释放等环节[4]。PI3K通过影响血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等进而影响动脉粥样硬化的发展。在炎症反应的进程中，PI3K信号通路的激活可使细胞产生大量的炎性因子[2]。Kang Q等[5]的研究发现抑制PI3K、AKT、TNF-a的mRNA表达对高脂饮食喂养的ApoE基因敲除的小鼠具有抗动脉粥样硬化的作用。Cx43在细胞膜形成缝隙连接起到细胞间的通讯作用。在开放状态下，炎症因子可从缝隙连接中通过使CX蛋白羧基端磷酸化，蛋白构象发挥变化，进而调节缝隙连接的功能。CHEN等[6]发现动脉粥样硬化的冠心病患者Cx43和Cx46的表达显著上调，细胞缝隙连接功能紊乱可能是动脉粥样硬化性疾病发病的原因之一。

本研究采用KLA诱导人冠状动脉内皮细胞炎性损伤构建内皮早期动脉硬化模型，采用PI3K特异性阻滞剂LY进行干预。本研究从细胞水平证实KLA可能通过激活TLR4/PI3K信号传导通路及其下游信号传导，上调TLR4、PI3K、Cx43蛋白和mRNA表达，进而调节促炎细胞因子表达，参与AS的炎症反应。使用PI3K信号通路特异抑制剂LY294002可以下调KLA诱导的TLR4、PI3K、cx43蛋白和mRNA的表达，进而减少AS炎症反应形成。为控制AS炎症反应提供更充足的实验依据。我们的这些发现也许能够冠状动脉粥样硬化的基础研究和临床治疗提供新的思路。

参考文献

[1] LIN J，KAKKAR V，LU X.Essential Roles of Toll-Like Receptors in Atherosclerosis[J].Curr Med Chem，2016，23（5）：431-454.

[2] FRUMAN D A，CHIU H，HOPKINS B D， et al. The PI3K Pathway in Human Disease[J].Cell，2017，170（4）：605-635.

[3] KOBIYAMA K，LEY K.Atherosclerosis[J].Circ Res，2018，123（10）：1118-1120.

[4] ROSHAN M H，TAMBO A，PACE N P.The Role of TLR2，TLR4，and TLR9 in the Pathogenesis of Atherosclerosis[J].Int J Inflam，2016，2016：1532832.

[5] KANG Q，WEIHONG L，HONGXU L，et al.Effect of Compound Chuanxiong Capsule on Inflammatory Reaction and PI3K/Akt/NF-kB Signaling Pathway in Atherosclerosis[J].Evidence-Based Complementary Alternative Medicine，2015：1-9.

[6] CHEN，CHEN，GE，et al.Monocytic cell junction proteins serve important roles in atherosclerosis via the endoglin pathway[J].Molecular Medicine Reports，2017.