车叶草苷对小鼠Lewis肺癌的抑瘤、抗炎作用及其机制

初巍巍，袁菲阳，丁国臣，吕文君，史昌乾

车叶草苷(Asperuloside)为环烯醚萜类化合物，主要来源于茜草科(Rubiaceae)如白花蛇舌草等植物，具有抗菌、抗氧化、抗诱变、抗肿瘤、消炎镇痛等广泛的药理作用[1,2]。Lewis肺癌细胞是来源于小鼠肺腺癌的细胞，恶性程度较高，肺腺癌是非小细胞肺癌中较为常见的病理分型[3]。化疗是临床治疗晚期非小细胞肺癌的重要手段，但常因不能完全消灭肿瘤细胞、残存微小转移灶、产生抗药性等不良反应而使其临床应用受到限制[4,5]。寻求一种与化疗药物配合应用的治疗用药显得尤为重要。车叶草苷具有良好的抗炎、抗肿瘤等药理作用，但尚未作为治疗用药[6]。本研究旨在观察车叶草苷对荷瘤小鼠的抑瘤、抗炎作用，并通过分子生物学检测手段，检测瘤体中TLR4/MYD88/NF-κB信号通路的活化情况，探讨车叶草苷抗炎、抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康C57BL/6J小鼠36只，体质量(20±2)g。购自辽宁长生生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2010-0001。实验动物购入后，常规颗粒饲料喂养，自由食水，12 h昼夜节律。

1.1.2 实验药品及制备 车叶草苷，上海钦诚生物科技有限公司生产，CAS：14259-45-1。顺铂，山东齐鲁制药生产，国药准字：H201510743。

1.1.3 主要试剂 IL-1β、TNF-α酶联免疫法检测试剂盒，购自武汉云克隆科技股份有限公司，货号：SEA563Mu、SEA133Mu。TLR4抗体(ab95562)；MYD88抗体(ab2064)；NF-κB抗体(ab16502)，均购自ABCAM公司。免疫组化SP试剂盒(货号：SP-9001)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DMEM培养液，购自海克隆公司。胎牛血清(FBS)，购自杭州四季青生物技术有限公司。Lewis细胞株系购自中科院上海细胞库。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法 36只小鼠适应性饲养1周后，于小鼠左侧腋下皮肤松弛部位的皮下接种Lewis细胞悬液，每只小鼠0.2 ml，然后正常饲养，每日观察左侧腋下成瘤情况。36只小鼠1周开始成瘤，而瘤体达3 mm×3 mm×3 mm以上的29只。随机分为3组：模型对照组10只，车叶草苷组9只，顺铂对照组10只。

1.2.2 干预方法 模型对照组：经口灌服生理盐水，0.5 ml/只，同时腹腔注射生理盐水，0.5 ml/只。车叶草苷组：参考李红霞等[7]研究，小鼠经口灌胃车叶草苷(50 mg/kg)，0.5 ml/只，同时腹腔注射生理盐水，0.5 ml/只。顺铂对照组：经口灌服生理盐水，0.5 ml/只，同时腹腔注射顺铂(1 mg/kg)，0.5 ml/只。各组干预1次/d，连续3周。给药期间，模型对照组死亡3只，车叶草苷组死亡1只，顺铂对照组死亡2只。

1.2.3 样本采集 末次给药后，称量并记录小鼠体重，麻醉状态下采血1 ml，室温静置1 h，3000 r/min，离心10 min，分离血清，冻存备用。然后断髓处死，于冰面上剥离肿瘤组织，称量肿瘤重量，将瘤组织均分，一份冻存于-80 ℃冰箱中；另一份浸泡在4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 指标检测 (1)体重变化。各组小鼠成瘤并随机分组后，在给药干预前称量体重并记录；取材处死前，称量体重并记录，对比各组小鼠给药前后体重变化。(2)瘤指数。各组小鼠末次给药后，剥离完整瘤组织并称重，以各自瘤重/体重的比值作为该小鼠的瘤指数，进行统计分析。(3)血清IL-1β、TNF-α含量。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量。检测方法按照试剂盒内说明书步骤进行。(4)western-blot法检测各组小鼠瘤组织中TLR4、MYD88、NF-κB表达水平。TBST洗膜后ECL发光，采集图像，测定条带的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该小鼠目的蛋白的相对表达水平，进行统计分析。(5)免疫组织化学法检测各组小鼠瘤组织中p-NF-κB表达水平。取固定的瘤组织，常规制备5 μm厚石蜡切片，烤片2 h，脱蜡至水，滴加3% H2O2去除内源性过氧化物酶。次日37 ℃复温1 h，洗片，滴加即用型二抗工作液，37 ℃孵育1 h，洗片，计数细胞核呈阳性表达的细胞百分率，并进行统计分析。

2 结 果

2.1 车叶草苷对荷瘤小鼠体重和瘤指数的影响 给药前各组小鼠体重比较均无统计学差异；给药3周后，与模型对照组和顺铂对照组比较，车叶草苷组小鼠体重显著增加，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。与模型对照组比较，车叶草苷组和顺铂对照组小鼠瘤指数显著降低，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 车叶草苷对荷瘤小鼠血清IL-1β、TNF-α的影响 与模型对照组比较，车叶草苷组和顺铂对照组小鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；车叶草苷组和顺铂对照组比较无统计学差异(表2)。

2.3 车叶草苷对荷瘤小鼠瘤组织中TLR4、MYD88、NF-κB表达的影响 与模型对照组比较，车叶草苷组和顺铂对照组小鼠瘤组织中TLR4、MYD88、NF-κB表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；车叶草苷组和顺铂对照组比较无统计学差异(表3，图1)。

组别例数体重(g)给药前给药后瘤指数(瘤重/体重)模型对照组722.54±2.5716.16±2.130.064±0.012车叶草苷组823.09±2.6819.00±1.44①0.041±0.009①顺铂对照组823.35±2.6816.19±1.760.044±0.010①

注：与模型对照组比较，①P<0.01

组别nIL-1βTNF-α模型对照组778.60±10.7387.14±14.54车叶草苷组849.10±6.10①61.32±6.91①顺铂对照组850.87±3.78①55.21±7.96①

注：与模型对照组比较，①P<0.01

组别例数Western-blot(aim/β-actin)TLR4MYD88NF-κB模型对照组70.513±0.0720.528±0.0650.557±0.068车叶草苷组80.405±0.029①0.396±0.077①0.377±0.057①顺铂对照组80.392±0.048①0.414±0.046①0.420±0.056①

注：与模型对照组比较，①P<0.01

图1 小鼠Lewis肺癌组织中TLR4、MYD88、NF-κB表达电泳图

2.4 车叶草苷对荷瘤小鼠瘤组织中p-NF-κB表达的影响 模型对照组瘤组织的p-NF-κB表达水平较高，阳性产物主要表达于瘤细胞的细胞核位置，见图2。与模型对照组(0.261±0.026)比较，车叶草苷组(0.171±0.026)和顺铂对照组(0.207±0.020)小鼠瘤组织中p-NF-κB表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；车叶草苷组和顺铂对照组比较无统计学差异。

图2 各组小鼠Lewis肺癌组织中p-NF-κB表达(DAB染色，×400倍)

3 讨 论

非小细胞肺癌约占所有肺癌患者总数的80%。Lewis细胞是小鼠来源的肺腺癌细胞，本研究选用Lewis细胞荷瘤鼠作为研究对象。为了让组间更具有可比性，我们选择瘤体达3 mm×3 mm×3 mm以上的小鼠进行实验，使得对车叶草苷抑瘤作用的观察更客观。

化疗是临床治疗晚期非小细胞肺癌的重要手段，但化疗引起患者的毒副反应明显[7]。车叶草苷主要来源于茜草科植物，如白花蛇舌草。车叶草苷的药理作用比较广泛，抗肿瘤作用也有报道，尚不够丰富。另有文献[8,9]报道，车叶草苷对TLR4/MYD88/NF-κB信号通路具有调控作用。因此，为了寻求新的治疗非小细胞肺腺癌的途径，我们观察了车叶草苷对Lewis荷瘤鼠的抑瘤作用，并探讨了部分作用机制。

肺腺癌发生时，瘤体内的炎性反应是肿瘤致病原因之一，而TLR4/MYD 88/NF-κB信号通路参与了肺腺癌瘤体内炎性反应的发生[10,11]。Toll样受体是一类作为模式识别受体(PRR)发挥作用的非催化受体，主要表达于上皮细胞及免疫细胞上，是识别损伤相关分子模式的主要受体[12]。TLR4是Toll样受体超家族成员之一。TLR4通过与配体结合的形式发挥生物学作用，二者结合形成TLR4/MD-2复合物，通过招募IL-1受体相关激酶家族成员等环节，最终导致NF-κB发生磷酸化，发挥调控IL-1β、TNF-α等促炎因子转录的作用，从而介导了瘤体内炎性反应的发生[13]。

本研究结果显示：模型对照组小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量处于较高水平，而车叶草苷干预后，细胞因子水平显著下降，提示车叶草苷对荷瘤小鼠全身的炎性反应状态具有抑制作用。另外，模型对照组小鼠瘤组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达水平较高，车叶草苷干预后，瘤组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达水平显著降低，提示车叶草苷干预后，显著抑制了荷瘤小鼠瘤组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化。免疫组织化学法检测的p-NF-κB结果，提示模型对照组瘤组织中出现了大量的细胞核p-NF-κB阳性表达的现象，而车叶草苷能够显著减少瘤组织中p-NF-κB阳性表达的细胞数量，进一步说明了车叶草苷对过度活化的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路具有抑制作用。

综上所述，车叶草苷对Lewis荷瘤鼠具有明显的抑瘤作用，能够降低荷瘤小鼠机体的炎性反应状态，该作用机制可能是通过抑制瘤组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的过度活化实现的。但是由于本研究自身的局限性，例如样本数小、研究对象种属等问题，我们无法得出车叶草苷抗肿瘤作用机制的明确结论，尚需进一步深入、全面地研究。