氧化石墨烯对紫花苜蓿幼苗生理生态特征的影响

朱先贵，赵树兰，多立安

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

碳纳米材料是指在三维空间尺度中至少有一维处于纳米量级（1～100 nm）的材料，目前碳纳米材料主要有石墨烯（graphene）、碳纳米管（carbon nanotubes）、富勒烯（fullerene）等.其中，石墨烯是由碳原子以sp2杂化轨道组成的平面二维晶体.氧化石墨烯（GO）是石墨烯的氧化物，一般由石墨经强酸氧化而得，作为一种性能优越的新型碳材料，在光电、热导涂料、太阳能电池及环境污染修复等诸多领域应用广泛[1].同时，GO的大量使用对环境造成的风险也随之增加，其环境效应逐渐引起研究者的关注[2-3].目前，关于GO 环境效应的研究涉及动植物以及微生物等各个方面.如Jia 等[4]的研究表明，GO 会影响斑马鱼肠道微生物的多样性，增加斑马鱼中的病原细菌群落，诱导对肠道组织的损害并激活炎症反应.Zhao 等[5]的研究表明，石墨烯对藻类会构成环境胁迫，藻类通过减少膜损伤和直接接触的机会来减轻石墨烯材料造成的损伤.Wang 等[6]的研究表明，GO 可以增强杀虫剂对昆虫的作用效果.

目前关于GO 对植物影响的研究多集中在禾本科. 如Shen 等[7]对水稻的研究发现，水培时加入GO（50 mg/L）会使水稻根长变短；殷玲玉[8]用水培法培育玉米时发现，培养液中加入GO（500 mg/L）使玉米苗的鲜重与对照相比减少了47%；Chen 等[9]的研究发现，水培时高浓度的GO（≥0.4 mg/mL）抑制了小麦的萌发.这些研究通常采用水培实验，土培盆栽很少见，而后者能够更精准地模拟GO 输入到土壤环境中对植物生长的影响.GO 进入土壤后对豆科植物及其固氮特性影响的研究鲜有报道，而豆科植物作为地球生物固氮的主体，生态价值极其重要[10-11].本研究以常见的豆科根瘤共生固氮植物紫花苜蓿（Medicago sativa）为模式植物，采用土培方式，观察紫花苜蓿在生长和生理生态特征方面对GO 胁迫作出的响应，以期为深入探讨GO 对豆科植物固氮作用机制的影响以及GO 应用对自然界生物固氮的风险评价提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

紫花苜蓿种子，购于北京正道种业有限公司.氧化石墨烯（GO），购自苏州碳丰科技有限公司，为褐黄色粉末，质量分数大于95%，平均厚度3.4～8.0 nm，片层直径10～50 μm，层数5～10 层，比表面积100～300 m2/g.土培基质取自天津师范大学校园内生物学试验区10～20 cm 深度的土壤，含盐质量分数0.1%，有机质4.68%，全氮0.22%，全钾45.61%，有效磷22.03 mg/kg，饱和含水量0.56 mL/kg，土壤容重0.87 g/cm，pH 值为7.45.

种子播种于塑料花盆（上下直径分别为23 cm 和17 cm，高18 cm）内，每盆装入2500 g 土壤，土壤中加入不同质量的GO，混匀.根据土壤中GO 的质量分数，共设置4个处理组：CK（不添加GO）、0.2%、0.4%和0.6%，每个处理4 次重复.每盆播种2 g，于室内采光良好处进行栽培，光照强度600～28000 Lx. 定期适量浇水，使土壤含水量保持在最大持水量的60%，培养期间环境平均温度约为25 ℃，空气相对湿度为17%～54%.种子萌发50 d 后测定相关指标.

1.2 指标测定方法

株高和生物量的测定：选取长势均匀且良好的植株用直尺测量绝对株高，5 次测量取平均值.将收获的植物地上部茎和叶分开，用蒸馏水洗净并用滤纸吸取水分后，在108 ℃下杀青20 min，再于80 ℃下烘干至恒重后称量.

叶片质膜透性的测定：取叶片剪碎，用10 mL 去离子水作为浸提液浸泡12 h，使用电导仪测定电导率R1，然后沸水浴加热30 min，冷却至室温后摇匀，测得浸提液电导率R2，计算电解质相对外渗率[12].

叶绿素和类胡萝卜素含量的测定：取叶片剪碎，避光，浸泡于无水乙醇与丙酮等体积混合液中，使用分光光度计（UV-1700，日本岛津公司）于663、645 和470 nm 处测量OD 值[13].

MDA 含量和抗氧化酶活性的测定[14]：MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸氧化法，POD 活性测定采用愈创木酚法，CAT 活性测定采用分光光度法，SOD 活性测定采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法.

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey 法在P = 0.05 水平进行数据差异的统计学意义检验，采用Origin 软件绘图.

2 结果与分析

2.1 GO 添加对紫花苜蓿株高和地上生物量的影响

土壤中添加不同质量的GO 后，紫花苜蓿的生长情况如图1 所示.由图1 可以看出，随着GO 质量分数的增加，紫花苜蓿茎、叶生物量和株高均呈现先增加后降低的趋势.0.2%GO 处理下，紫花苜蓿的茎、叶生物量较对照组显著增加（P ＜0.05），株高较对照组轻微增加，差异不显著（P ＞0.05）.0.4%和0.6%GO 处理组中，紫花苜蓿的茎、叶生物量和株高均显著降低，且GO 添加量越大，紫花苜蓿生长越差，GO 质量分数为0.6%时，与对照组相比，茎、叶生物量分别降低了52.72%和81.96%，株高降低了26.09%.

2.2 GO 添加对紫花苜蓿叶片质膜透性的影响

土壤中添加不同质量的GO 后，紫花苜蓿的叶片质膜透性如图2 所示.由图2 可以看出，随着GO 质量分数的增加，质膜透性呈现先减后增的趋势.与对照组相比，0.2%GO 处理组中紫花苜蓿叶片的质膜透性降低了21.30%（P ＜0.05）. 与对照组相比，0.4%GO 处理组中叶片的质膜透性略有增加（P ＞0.05），0.6%GO处理组增加了41.11%，差异具有统计学意义（P ＜0.05）.

图1 不同GO 处理组中紫花苜蓿的株高和生物量Fig.1 Plant height and biomass of Medicago sativa in different GO treatment groups

图2 不同GO 处理组中紫花苜蓿的叶片质膜透性Fig.2 Plasma membrane permeability of Medicago sativa leaves in different GO treatment groups

2.3 GO 添加对紫花苜蓿叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的影响

不同GO 处理组中，紫花苜蓿的叶绿素和类胡萝卜素含量如表1 所示.由表1 可以看出，叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量均随着GO 质量分数的增加而减少.与对照组相比，0.2%处理组中的叶绿素a 含量略有下降（P ＞0.05），叶绿素b 和总叶绿素含量显著下降；0.4%和0.6%GO 处理组中，三者均显著降低.类胡萝卜素含量随着GO 浓度升高呈现先升后降的趋势，与对照组相比，0.2%GO 处理组中类胡萝卜素含量显著提高了67.28%，0.4%和0.6%GO 处理组分别降低了21.60%和38.89%，差异具有统计学意义（P ＜0.05）.

表1 不同GO 处理组中紫花苜蓿叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量Tab.1 Chlorophyll and carotenoid contents of Medicago sativa leaves in different GO treatment groups（mg·g-1）

2.4 GO 添加对紫花苜蓿丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响

不同GO 处理组中，紫花苜蓿的MDA 含量如图3（a）所示，抗氧化酶活性如图3（b）—图3（d）所示.由图3（a）可以看出，紫花苜蓿叶片和茎中的MDA 含量均随着GO 质量分数的升高呈现先降后升的趋势.0.2%GO 处理组中，叶和茎的MDA 含量与对照组相比均显著下降；0.4%GO 处理组中，叶的MDA 含量与对照组相比略有增加（P ＞0.05），茎的MDA 含量较对照组增加了19.76%（P ＜0.05）；0.6%GO 处理组中，叶和茎的MDA 含量与对照组相比均显著增加（P ＜0.05）.

由图3（b）可以看出，叶和茎中的CAT 活性均随着GO 质量分数的升高呈增加趋势. 与对照组相比，3个GO 处理组中，叶中的CAT 活性均显著增加，0.6%GO 处理组增加了110.53%；0.2%和0.4%GO 处理组中，茎中的CAT 活性较对照组略有增加，0.6%GO处理组与对照组相比增加了34.56%（P ＜0.05）.由图3（c）和图3（d）可以看出，紫花苜蓿茎、叶中的SOD 和POD 活性均随着GO 质量分数的升高呈现先降后升的趋势.0.2%GO 处理组中，叶和茎的SOD 和POD 活性与对照组相比均显著下降（P ＜0.05）；0.4%GO 处理组中，叶片的SOD 和POD 活性与对照组的差异不显著（P ＞0.05），茎的SOD 和POD 活性均显著高于对照组（P ＜0.05）；0.6%GO 处理组中，叶片的SOD 活性显著高于对照组（P ＜0.05），POD 活性与对照组相比差异不显著（P ＞0.05），茎的SOD 和POD 活性均显著高于对照组（P ＜0.05）.

图3 不同GO 处理组中紫花苜蓿的MDA 含量和抗氧化酶活性Fig.3 MDA content and antioxidant enzyme activity of Medicago sativa in different GO treatment groups

3 讨论与结论

环境中的GO 会在一定程度上影响植物的生长和生理特征.本研究利用添加不同质量GO 的土壤培养豆科植物紫花苜蓿，结果发现，随着GO 质量分数的增加，紫花苜蓿的生物量和株高均呈现先升后降的趋势，表明高浓度GO 对植株生长有显著的抑制作用. 低浓度GO 处理下（0.2%）紫花苜蓿的生物量显著增加，株高增加不显著.Chen 等[15]的研究发现燕麦在低浓度（0.04 mg/mL）GO 处理下地上部分干重较对照组增加，而当GO 浓度继续增加时燕麦干重显著减少，这与本研究得到的结果一致.质膜透性是反映细胞膜透性的重要依据，通常逆境胁迫程度越高，质膜透性越大，表明细胞膜的选择透过性越差[16].本研究发现，较高浓度GO 处理下（≥0.4%）紫花苜蓿叶片的质膜透性显著提高，说明GO 的添加对紫花苜蓿构成了逆境胁迫，而低浓度GO（0.2%）处理下紫花苜蓿质膜透性反而降低.有研究表明，与叶相比，环境胁迫对紫花苜蓿根部结瘤部位造成的细胞膜破坏更严重，也更难恢复，从而阻碍了根瘤的生长[17].因此推测，GO 胁迫对紫花苜蓿根部的细胞膜会造成严重破坏.

叶绿素是完成光合作用必不可少的组分，与植物生长有着密切的联系.本研究表明，GO 处理下紫花苜蓿叶绿素含量显著降低，可能是GO 形成的环境胁迫抑制了叶绿素的合成.Jokinen 等[18]研究表明，豆科植物的固氮需要很多光合产物.当叶绿素含量下降时，光合作用必然受到影响，豆科植物的固氮效率也会下降.GO 对植物的影响因GO 浓度、植物与GO 的接触时间、植物自身种类不同而有差异[19].王鑫禹等[20]的研究表明，高羊茅培养到50 d 时基质中添加1%的GO，与对照相比株高增加了4.03%，叶绿素a、b 含量无显著变化.而紫花苜蓿在GO 添加超过0.4%时就表现出明显的胁迫反应，株高和叶绿素含量均显著下降.由此可知，与禾本科植物高羊茅相比，紫花苜蓿对GO 添加更敏感.

植物在逆境胁迫下，细胞产生的活性氧增加，抗氧化防御系统会提高CAT、POD、SOD 等酶的活性，其中，SOD 可以催化超氧自由基反应产生H2O2，POD 和CAT 可以催化H2O2反应，以此来消耗过量的活性氧，减轻活性氧带来的胁迫[21].本研究结果表明，高浓度GO处理下，紫花苜蓿的CAT、POD、SOD 活性均有显著提高，这是因为高浓度GO 对紫花苜蓿造成了胁迫，使紫花苜蓿的抗氧化防御系统提高相关酶的活性.而低浓度GO 对紫花苜蓿生长有一定促进作用，所以0.2%GO处理下POD、SOD 含量较对照组都有所降低.MDA 是反映膜脂过氧化程度的指标，其含量的增加会加剧膜损伤.本研究中，在高浓度GO 处理组中紫花苜蓿的MDA 含量较对照组显著增加，说明此时紫花苜蓿受到胁迫，而低浓度GO 处理组中MDA 含量较对照组减少，是因为低浓度下GO 对紫花苜蓿生长具有一定促进作用，这与保护酶活性以及叶片质膜透性的变化趋势一致.Chen 等[15]研究发现，GO 对水培和土培的裸燕麦均造成了氧化胁迫，CAT 和MDA 含量随GO 浓度增加而提高.在紫花苜蓿的环境胁迫研究中，Salah 等[17]发现盐胁迫对紫花苜蓿生长的影响与电解质泄漏有关，盐胁迫使叶片电解质泄露增加6 倍，使结瘤部位电解质泄露增加5 倍，而且盐胁迫会使根部结瘤处和叶片的SOD 酶活性增加.因此，本研究推测GO 可能是通过改变细胞质膜透性对紫花苜蓿产生胁迫作用.

综上所述，GO 处理对紫花苜蓿的生长和生理生态特征有显著影响，较低浓度的GO 处理就可能会使紫花苜蓿受到严重胁迫.GO 添加到土壤后，降低了紫花苜蓿的叶绿素含量，抑制了光合作用，不利于其生长，而且随GO 质量分数的增加抑制作用增强，SOD、POD 和CAT 活性升高，MDA 含量也会增加.基于这些结果，本课题组将进一步探究GO 对苜蓿等豆科植物结瘤及固氮机制等方面的影响.