基于网络药理和分子对接技术预测热炎宁合剂抗COVID-19作用△

王梅，唐志书，刘妍如，宋忠兴，周瑞，许洪波，于金高，赵梦利，周建平

1.陕西中医药大学 附属医院，陕西 咸阳 712083；2.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心/秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育)/ 陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083；3.清华德人西安幸福制药有限公司，陕西 西安 710043

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在世界范围内的大规模传播是2020年初流行病学的重大事件，其危害及规模已超过H1N1流感。虽然目前我国对COVID-19采取了有效的控制措施，使其确诊率大大降低；然而，2020年3月9日，世卫组织发布的最新COVID-19情况报告称，当前COVID-19在全球100多个国家地区蔓延，病例数超10万，COVID-19成为大流行(病)的威胁已变得非常现实。有研究表明病毒已经出现变异，每个国家病毒的传染性和毒性有了不同改变，而针对新型冠状病毒[世界卫生组织(WHO)将其命名为2019 novel coronavirus(2019-nCoV)，国际病毒分类委员会将其命名为severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)]的疫苗尚未研制成功，有效干预COVID-19的上市药物也很少，其临床有效性和安全性仍待观察。在无明确病因、无特效药、无疫苗的情况下，我国中医发挥所长，针对COVID-19“湿、热、毒、瘀”的核心病机，侧重增强机体的抵抗能力和修复能力，不断开发出“对症”的复方方剂，为疫情控制提供了有效的防治策略。

热炎宁合剂是《陕西省新型冠状病毒感染的肺炎中医药治疗方案(试行第二版)》中对于治疗COVID-19临床轻、重症的推荐指定用药。该制剂由半枝莲、虎杖、北败酱和蒲公英组成，具有清热解毒、消痈散结的功效[1]。为了系统评价热炎宁合剂对COVID-19的干预作用，筛选其中具有抗2019-nCoV活性的成分。本研究基于中医药整体性、系统性的研究策略，采用网络药理学方法构建“中药-成分-疾病-靶点”关联网络，从整体预测药物靶点、作用通路和干预机制，以分子对接技术对抗病毒活性成分进行虚拟筛选，以阐释其治疗作用内涵。

1 资料与方法

1.1 热炎宁合剂干预COVID-19的可行性

1.1.1化学成分收集与筛选 从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http：//www.tcmspw.com)、中国天然产物化学数据库(http：//www. pharmdata.ac.cn/cnpconline/)中，以热炎宁中组方中药蒲公英、虎杖、北败酱和半枝莲为搜索词，收集各组方中药的主要化学成分[2]。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%或类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18作为进一步筛选条件。

1.1.2“成分-疾病”靶点筛选 从TCMSP、Drugbank(https：//www.drugbank.ca/)、Pubchem(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中搜索化合物对应的靶点，以UniProt数据库(http：//www.uniprot.org/uniprot/)对收集的靶点进行规范化和校正，建立成分相关的基因靶点列表。以“SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)”“Respiratory Failure”为关键词，在OMIM数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、MalaCards数据库(https：//www.malacards.org/)和TTD数据库(Therapeutic Targets Database，http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)中搜索已报道的与冠状病毒感染相关的基因。剔除重复和假阳性基因后，建立冠状病毒感染相关的靶点基因列表。

1.1.3“成分-疾病-靶点”网络构建 对上述得到的成分相关靶点和疾病相关靶点取靶点交集。将交集内靶点以STRING 11.0数据库(https：//string-db.org/)，查询蛋白相互作用信息，构建PPI(Protein to Protein Interaction)网络，参数设置：种属为人类(Homosapiens)。

对PPI网络的蛋白互作信息、“成分-疾病-靶点”及“中药-成分”信息进行整合，将整理后数据分别Cytoscape 3.7.2软件，构建“中药-成分-疾病-靶点”关联网络。成分与中药、疾病和靶点之间的关系用网络的节点和边来描述，通过Cytoscape的Network analysis插件来分析并提取网络节点和边的特征。

1.1.4生物过程注释及代谢通路分析 为了阐述热炎宁合剂与疾病相关成分的靶点在生物过程中的功能的作用机制，以R软件包(3.6.2)的Cluster profiler包对“成分-疾病-靶点”网络中的重要靶点进行GO(Gene Ontology)生物信息学富集，以3个本体(Ontology)描述基因靶点的分子功能(Molecular Function，MF)、所处的细胞位置(Cellular Component，CC)和参与的生物过程(Biological Process，BP)[3]；以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/)数据库富集靶点基因参与的主要生化代谢途径，并对其关联关系进行注释，以P<0.05为显著性差异判定卡值。采用ggplot2包对GO和KEGG通路富集结果进行可视化处理。

1.2 热炎宁合剂抗2019-nCoV的活性化合物预测

1.2.1靶点与配体预处理 以上海科技大学饶子和/杨海涛课题组公布的COVID-19 3CLpro高分辨率晶体结构(PDB ID：6LU7)为对接模板，采用Schrodinger-2018软件的Protein preparation wizard模块对6LU7结构进行加氢、去水、去杂原子等预处理。以6LU7原配体化合物为参照，以1.1中筛选的活性成分为对接配体，采用Ligprep模块对各成分结构(*.sdf)进行加氢等优化预处理后生成批量处理文件。

1.2.2分子对接 以原始配体分子为中心，采用Receptor Grid Generation 模块生成格点文件(盒子大小设为14Å)。以6LU7作为刚性受体，热炎宁合剂活性成分结构作为构象可变化(柔性)配体，进行半柔性对接。由于Docking Score值<-7.0时说明受体-配体间有很高的结合活性，因此对接结果以对接打分值docking core≤-7.0作为筛选条件[4]。

2 结果与分析

2.1 热炎宁合剂干预COVID-19的网络构建

2.1.1活性成分筛选 结合TCMSP数据库和中国天然产物化学数据库收载的热炎宁合剂组方中药成分，一共得到156个成分。OB≥30%或DL≥0.18作为进一步筛选条件，得到符合筛选标准的活性成分49个。

2.1.2“成分-疾病-靶点”筛选 从TCMSP和PubChem数据库中搜索得到热炎宁合剂的49个活性成分对应的靶点共有239个，以Uniprot数据库搜索校正后生成“成分-靶点”集合。从MalaCards数据库、TTD数据库和OMIM 数据库中得到关于冠状病毒感染诱发的“SARS”和“Respiratory Failure”相关的靶点共计144个，生成“疾病-靶点”集合。将上述得到的“成分-靶点”和“疾病-靶点”集合取靶点交集，并绘制交集维恩图，得到交集靶点35个(见图1A)。将交集内靶点以STRING 11.0构建PPI(Protein to Protein Interaction)网络(见图1B)，PPI网络中共有35个节点，264条边，平均节点数为15.1，平均边数57条。以k-means法对靶点进行聚类，得到3个分类，以从红色到蓝色表示基因计数(gene count)由大到小。

2.1.3“中药-成分-靶点”网络构建分析 将2.1.2筛选得到的35个靶点与中药进行映射关联，得到29个化学成分的“成分-靶点”关联表，与PPI互作表一同导入Cytoscape 3.7.2软件，构建热炎宁合剂的“中药-化合物-靶点”关联网络。如图1C所示(红色：活性化合物；绿色：靶点；蓝色：组方中药)，所构建的关联网络包括68个节点(4种中药，29个成分，35个靶点)和480条边。网络图中以节点大小表示度数大小，度数的大小代表该节点在网络中的重要性；接近中心度大小表示节点在网络中的中心度。该网络中成分度值较大，接近中心度>0.45的化合物为槲皮素(度数=42)、木樨草素(度数=45)、蒲公英萜酮(度数=24)、β-谷甾醇(度数=12)和芹菜素(度数=12)。网络中度数较大，接近中心度>0.45的靶点为环氧化酶1(PTGS1)(度数=38)、肿瘤坏死因子(TNF)(度数=33)、白细胞介素6(IL6)(度数=33)、白细胞介素10(IL10)(度数=32)、白细胞介素1β(IL1B)(度数=30)和C-C趋化因子配体2(CCL2)(度数=28)等15个靶点。相比其他3个中药，该网络中半枝莲度数(度数=49)和接近中心度数值(0.47)较大，说明半枝莲是热炎宁合剂在干预COVID-19中较为重要的组方中药，其主要成分木樨草素、芹菜素和β-谷甾醇可通过作用于PTGS1(度数=38)、IL6(度数=33)和IL10(度数=32)发挥作用。其次，虎杖在网络中度值(度数=40)和接近中心度(0.40)也较高，其主要成分槲皮素、木樨草素和β-谷甾醇可作用于PTGS1、IL6、IL10、IL1B和CCL2发挥作用。以上结果表明热炎宁合剂在干预COVID-19的过程中具有多成分、多靶点的协同作用。

2.1.4热炎宁合剂干预COVID-19的生物信息富集及代谢通路注释 将“中药-成分-疾病”网络中筛到的对应的15个靶点通过Cluster profiler进行生物信息学GO富集分析和KEGG通路注释，共富集到24条生物学过程，7条代谢通路。GO富集分析结果，见图2，这些靶点主要分布于细胞外空间(GO：0005615，extracellular space)和质膜外侧(GO：0009897，external side of plasma membrane)。其MF主要与细胞因子活性(GO：0005125，cytokine activity)、细胞因子受体结合(GO：0005126，cytokine receptor binding)、分子功能调节剂(GO：0098772，molecular function regulator)、生长因子受体结合(GO：0070851，growth factor receptor binding)和趋化因子活性(GO：0008009，chemokine activity)有关。BP主要涉及信号转导受体活性的调节(GO：0010469，regulation of signaling receptor activity)、对脂多糖的反应(GO：0032496，response to lipopolysaccharide)、炎症反应(GO：0006954，inflammatory response)、防御反应(GO：0006952，defense response)和免疫系统过程的正向调节(GO：0002684，positive regulation of immune system process)。这些靶点主要参与的代谢通路为：细胞因子受体相互作用通路(hsa04060，Cytokine-cytokine receptor interaction)和IL-17信号通路(hsa04657，IL-17 signaling pathway)。

注：A.“成分-疾病”靶点交集韦恩图；B.筛选靶点PPI图；C.“中药-成分-靶点”关联图(蓝色为中药；红色为成分；绿色为靶点)。图1 热炎宁合剂“中药-成分-疾病-靶点”网络关联图构建

2.2 热炎宁合剂中潜在2019-nCoV 3CL pro(PDB ID：6LU7)抑制剂筛选

2.2.1对接体系验证 通过将对接前后的6LU7原始配体进行构象叠合来验证对接体系的准确度，结果显示均方根偏差(RMSD)值为1.281 3Å < 2Å，说明该对接体系适用于配体成分与受体6LU7的半柔性对接。

2.2.2热炎宁合剂化合物对接测试 将“中药-成分-疾病-靶点”网络中的29个化合物与对接体系(包括6LU7预处理受体和格点文件)进行对接测试，以对接打分值 ≤-7.0作为筛选条件，结果得到符合筛选标准的化合物7个，具体信息见表1，对接结果表明，大部分化合物主要和受体结合位点发生氢键作用，且这些化合物主要为黄酮类化合物，其结合主要为4位羰基氧和GLU166形成氢键，7位和4′位羟基分别和LEU141、CYS145、ASP187形成氢键(见图3)。中药归属显示，这7个化合物主要归属为半枝莲，说明该中药可能是热炎宁合剂中发挥抗病毒作用的主要中药，说明热炎宁合剂中干扰病毒复制的有效成分主要来自于半枝莲的黄酮类化合物。

图2 热炎宁合剂靶点GO富集及KEGG通路注释

3 讨论

热炎宁合剂由半枝莲、虎杖、北败酱和蒲公英组方而成。方中半枝莲味辛、苦，归肺、肝、胃经，以清热解毒见长，又具化瘀利尿之效。虎杖性微寒，味微苦。归肝、胆、肺经，具有祛风利湿、止咳化痰的功效，又可利湿破瘀。北败酱微寒，味苦，归大肠、肝经，既可清热解毒，又可活血化瘀；蒲公英性寒，味甘、苦，具有清热解毒，利尿散结的作用。四药协同为用，既可针对发热、咳嗽发挥清热解毒、止咳化痰的功效，又可针对并发症发挥利湿破瘀、活血散结的功效。目前，陕西省传染病医院(西安市第八医院)、西安交通大学第二附属医院、湖北省松滋市人民医院等多家医院已将热炎宁合剂作为治疗COVID-19的临床一线制剂。

注：橙色球棍模型为候选化合物分子；蓝色为氮原子；红色为氧原子。图3 6LU7与热炎宁合剂活性化合物相互作用图

表1 热炎宁合剂活性化合物对接、筛选结果及关联中药分析

对接成分对接打分化学成分相对分子量中药MOL000008-8.051芹菜素apigenin270.25半枝莲、虎杖、北败酱、蒲公英MOL012251-7.638白杨素甲醚chrysin-5-methylether268.28半枝莲MOL012249-7.5287,2′-dihydroxy-5,8-dimethoxyflavone314.31半枝莲MOL001040-7.455(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one272.27半枝莲MOL012250-7.4417-hydroxy-5,8-dimethoxy-2-phenyl-chromone298.31半枝莲MOL012247-7.3775,7-dihydroxy-8-methoxy-2-(2-methoxyphenyl)chromone314.31半枝莲MOL000492-7.069儿茶素catechin290.29虎杖、北败酱、蒲公英

尽管已有大量临床研究、病理学、分子生物学研究证明了热炎宁合剂对呼吸系统感染的有效性，其作用机制仍然未有阐明[5-8]。因此，本研究通过对热炎宁合剂“中药-成分-疾病-靶点”网络进行网络拓扑学分析发现，热炎宁合剂中的活性成分与冠状病毒感染诱发的“急性呼吸综合征”的15个靶点相关。其中，CCL2、CD40LG、CXCL10、CXCL8、IFNG、IL10、IL13、IL1B、IL2和IL6在关联网络中占有重要地位。靶点生物信息学的富集结果显示，热炎宁合剂中的活性成分可能通过参与多种生物途径发挥干预COVID-19的作用，主要涉及细胞因子受体相互作用通路和IL-17信号通路，这些生物过程与病毒感染造成的“细胞因子风暴”密切相关。细胞因子风暴易导致肺上皮细胞和肺血管内皮细胞的损伤，引起急性肺损伤(ALI)的病理改变，出现肺血管通透性增高、肺水肿等临床表征[9-11]。已有研究根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中医治疗方案对COVID-19临床轻、中度的病症表现，建立了模拟人类COVID-19的动物模型，对热炎宁合剂的有效性进行了实验性评价。研究结果显示，热炎宁合剂能显著降低模型动物的肺指数、肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)含量及血清胃动素含量，能够显著提升外周血CD8+T淋巴细胞和CD4+T 淋巴细胞百分比[12]。

以上研究说明热炎宁合剂在改善2019-nCoV感染导致的急性炎症及机体过度免疫反应方面有很好的潜力，具有“治标”作用。同时本研究也对热炎宁合剂中可能干扰病毒复制的化合物进行了筛选，以期找到“治本”的关键信息。因此，本研究以2019-nCoV复制过程中的重要水解酶3CLpro为对接靶点，以“成分-疾病-靶点”网络中的24个关键化合物作为配体，采用分子对接技术筛选得到7个对3CLpro有潜在抑制作用的化合物，说明这些化合物在发挥抗COVID-19作用的同时，也具有抗病毒的潜力(见图4)。

注：绿色为中药；橙色为成分；蓝色为靶点；紫色为KEGG代谢通路。图4 热炎宁合剂干预COVID-19的“成分-靶点-通路”预测网络

综上所述，本研究对热炎宁合剂干预COVID-19的活性成分、靶点及通路进行了探索性研究，并筛选了抗2019-nCoV的活性成分。分析结果初步表明，热炎宁合剂组方的半枝莲和虎杖是“中药-成分-靶点-通路”网络中的重点中药，其黄酮类成分如芹菜素、白杨素甲醚等是抗炎、抗病毒的主要成分。综合代谢通路注释结果说明热炎宁合剂可通过多成分、多靶点、多通路的互作模式达到兼顾“治标”和“治本”的治疗作用。