百令胶囊加还原型谷胱甘肽含药血清对NRK-49F细胞增殖的影响

朱戈丽，林 莉，伍 军，毕智敏，巩雪敏，李菊霜

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多种慢性肾脏疾病发展为终末期肾病的主要途径。百令胶囊是人工培养的一种冬虫夏草菌丝，具有增强免疫力、抗纤维化、保护肾功能等作用[1]。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸组成的一种三肽，在机体的脂质过氧化损伤中具有重要作用[2]。已有研究[3]表明，百令胶囊和GSH均可以抑制RIF，保护肾组织结构和功能损伤，但其具体的保护机制尚不清楚。课题组前期研究[4]显示，百令胶囊联合GSH可以抑制单侧输尿管梗阻大鼠的肾组织纤维化。因此，该研究从细胞水平上分析了百令胶囊加GSH含药血清对大鼠间质成纤维细胞NRK-49F的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD雄性大鼠20只，7～8周龄，体质量250～300 g，购自三峡大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(鄂)2017-0012，保持室温恒定为25 ℃，模拟昼夜光照，自由摄食与饮水。

1.2 仪器与试剂酶标仪(MULTISKAN MK3)购自美国Thermo公司；CO2恒温培养箱(MCO-15AC)购自日本SANYO公司；大鼠肾成纤维细胞NRK-49F由上海拜力生物科技有限公司提供；百令胶囊购自杭州中美华东制药有限公司(国药准字Z10910036)；GSH购自上海复旦复华药业有限公司(国药准字H20031265)；CCK8检测试剂盒由广州Biosharp提供；无支原体胎牛血清购自美国Gibco公司；兔抗大鼠增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)抗体、Sma和Mad相关蛋白2(sma and mad-related protein，Smad2)抗体、磷酸化Smad2(phosphorylation of Smad2，p-Smad2)抗体、Smad3抗体、p-Smad2抗体、α肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体、辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂均购自日本TaKaRa公司；PCR引物由南京金斯瑞有限公司合成。

1.3 动物含药血清的制备大鼠禁食水12 h后，采用结扎左侧输尿管建立单侧输尿管梗阻大鼠模型[5]。治疗组大鼠每日给予百令胶囊1.5 g/kg联合GSH 300 mg/kg灌胃治疗，治疗时间为术前1 d至术后第9天；模型组给予等体积的生理盐水灌胃。无菌采集各组大鼠血液，3 000 r/min离心10 min，56 ℃水浴锅灭活补体30 min；经0.22 μm滤菌膜过滤除菌，置于-80 ℃冰箱备用。

1.4 细胞培养将对数生长期细胞分为正常对照组、模型组、阴性对照组和药物干预组。正常对照组采用含5%胎牛血清的DMEM培养大鼠肾成纤维细胞NRK-49F；模型组用含有10 ng/ml TGF-β1的DMEM培养基培养NRK-49F细胞，诱导纤维化；阴性对照组用含有10%模型组大鼠血清和10 ng/ml TGF-β1的培养基培养NRK-49F细胞；药物干预组用含有10%治疗组大鼠的含药血清和10 ng/ml TGF-β1的培养基培养NRK-49F细胞。显微镜下观察各组细胞形态。

1.5 CCK8检测各组细胞增殖取各组NRK-49F细胞，置37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养48 h。待细胞培养至设定时间后，每孔加入10 μl CCK8，37 ℃培养4 h；酶标仪450 nm处测定各孔吸光值 (optical density，OD)，计算细胞存活率=(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)，每组重复6次。

1.6 流式细胞仪检测各组细胞周期分布将各组对数期细胞，1 000 r/min离心5 min，制成单细胞悬液，加入1 ml 75%乙醇、-20 ℃固定24 h，加入0.4 μl PI(30 mg/ml)混合，避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期，ModFit LT分析并拟合计算各时期细胞百分比。Western blot检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1的表达，每组重复6次。

1.7 RT-PCR检测各组细胞TGF-β1/Smad信号通路转录水平的表达取各组对数生长期细胞，TRIzol法提取各组细胞的总RNA，采用紫外分光光度计确定RNA浓度，经反转录试剂盒合成cDNA，进行实时定量PCR反应，以GAPDH作为内参，反应引物、体系和条件参考已有文献[6]，每组重复6次。

1.8 Western blot检测各组细胞TGF-β1/Smad信号通路蛋白表达水平取各组对数生长期细胞，采用细胞裂解液提取总蛋白， BCA法进行蛋白定量，取50 ng蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜，室温密封2 h，采用TBST洗膜并加一抗Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3(稀释比例均为1 ∶ 1 000)，于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜加HRP标记的二抗IgG(稀释比例均为1 ∶ 5 000)，于室温下孵育2 h。再用ECL化学发光显示，收集影像，用凝胶图像处理系统分析对比条带强弱，选用β-actin作为内参，每组重复6次。

2 结果

2.1 各组大鼠NRK-49F细胞的形态正常对照组NRK-49F细胞排列紧密，呈长梭形；模型组和阴性对照组NRK-49F细胞体积增大，呈短梭或多角形，胞核增大呈圆形或椭圆形；药物干预组NRK-49F细胞生长状态接近正常对照组。见图1。

2.2 百令胶囊联合GSH对大鼠NRK-49F细胞增殖的影响CCK8实验显示，与正常对照组比较，模型组和阴性对照组NRK-49F细胞的增殖活性增加(P<0.05)；与阴性对照组比较，药物干预组NRK-49F细胞的增殖活性下降(P<0.05)。Western blot 显示，与正常对照组比较，模型组和阴性对照组NRK-49F细胞PCNA的表达上调(P<0.05)；与阴性对照组比较，药物干预组NRK-49F细胞PCNA的表达下调(P<0.05)。见图2、表1。

图1 各组大鼠NRK-49F细胞的形态 ×100

A：正常对照组；B：模型组；C：阴性对照组；D：药物干预组

图2 Western blot法检测各组NRK-49F细胞PCNA蛋白的表达

表1 百令胶囊联合GSH对大鼠NRK-49F细胞增殖的影响

与正常对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

2.3 百令胶囊联合GSH对大鼠NRK-49F细胞周期的影响流式细胞术检测显示，与正常对照组比较，模型组和阴性对照组NRK-49F细胞G0/G1期细胞减少(P<0.05)，S期细胞增加(P<0.05)；与阴性对照组比较，药物干预组NRK-49F细胞G0/G1期细胞增加(P<0.05)，S期细胞减少(P<0.05)。Western blot 检测显示，与正常对照组比较，模型组和阴性对照组NRK-49F细胞Cyclin D1的表达上调(P<0.05)；与阴性对照组比较，药物干预组NRK-49F细胞Cyclin D1的表达下调(P<0.05)。见图3、表2。

图3 Western blot法检测各组NRK-49F细胞Cyclin D1蛋白的表达

2.4 百令胶囊联合GSH对TGF-β1/Smad信号通

表2 百令胶囊联合GSH对大鼠NRK-49F细胞周期的影响

与正常对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

路表达的影响Western blot 检测显示，与正常对照组比较，模型组和阴性对照组NRK-49F细胞Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表达上调(P<0.05)；与阴性对照组比较，药物干预组NRK-49F细胞Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表达下调(P<0.05)。见图4、表3。

图4 Western blot法检测各组细胞TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的表达

2.5 百令胶囊联合GSH对TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白转录水平的影响RT-PCR检测显示，与正常对照组比较，模型组和阴性对照组NRK-49F细胞Collagen Ⅰ、α-SMA、Smad2、Smad3 mRNA的表达上调(P<0.05)；与阴性对照组比较，药物干预组NRK-49F细胞Collagen Ⅰ、α-SMA、Smad2、Smad3 mRNA的表达下调(P<0.05)，见表4。

表3 百令胶囊联合GSH对NRK-49F细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

与正常对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

表4 百令胶囊联合GSH对TGF-β1/Smad信号通路转录水平的影响

与正常对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

3 讨论

成纤维细胞在缺血、缺氧、炎症等刺激下的过度活化、增殖是导致RIF的主要因素之一[7]。TGF-β1是RIF过程中的关键促纤维化因子，可以刺激肾小管上皮细胞产生细胞外基质，并抑制细胞外基质的降解，促进RIF[8]。本研究显示，经TGF-β1诱导的NRK-49F细胞呈短梭形或多角形，出现了细胞表型的转变。基于本课题组前期研究[4]，百令胶囊联合GSH可以有效抑制RIF的产生，保护肾脏组织。因此，本研究将体内实验与体外实验相结合，采用大鼠百令胶囊加GSH含药血清与NRK-49F细胞进行孵育，从细胞水平上分析其作用机制。本研究中，经TGF-β1诱导的NRK-49F细胞存活率增加，百令胶囊联合GSH含药血清作用后可以抑制NRK-49F细胞过高的增殖活性，G1期细胞数量减少，S期细胞数量增加，且细胞增殖蛋白PCNA和细胞周期蛋白Cyclin D1的表达下降。PCNA是一种与细胞DNA合成相关的增殖细胞核抗原，在细胞增殖的过程中具有重要作用。Cyclin D1为G1期细胞周期素，能够促进细胞通过G1/S检查点。姚素花 等[9]的研究显示，百令胶囊可以降低腹液透析患者的TGF-β1水平，抑制RIF。秦静 等[10]的研究显示，GSH可以抑制TGF-β1的表达，抑制肝组织的纤维化，本研究结果与之基本一致，提示百令胶囊联合GSH可能通过抑制TGF-β1的表达，诱导细胞周期阻滞，抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞增殖。

有研究[11-12]显示，TGF-β/Smad信号通路在RIF的发生发展过程中具有重要作用。Smad蛋白是将TGF-β1从受体到细胞核内的重要信号转导分子，包括Smad2、Smad3、Smad4等，通过与其他DNA结合蛋白作用调节靶基因转录。当TGF-β在胞膜与其受体结合后，可磷酸化Smad2和Smad3，使其活化，而活化的Smad2、Smad3与Smad4结合共同形成一个三聚体，共同转移到细胞核内，进一步来调节下游效应分子α-SMA、基质金属蛋白酶等，诱导RIF产生。本研究中，TGF-β1诱导的NRK-49F细胞Smad2和Smad3的磷酸化水平升高，α-SMA和Collagen I的表达上调，百令胶囊联合GSH含药血清作用后可以抑制Smad2和Smad3的磷酸化，下调α-SMA和Collagen I的表达，提示百令胶囊联合GSH含药血清可能通过抑制TGF-β1的表达，抑制Smad2和Smad3的磷酸化，抑制RIF。α-SMA是成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的标志，可以促进细胞外基质的分泌和沉积，促进RIF的发生。Collagen I是细胞外基质的主要成分，在RIF的病理过程中发挥了重要作用。熊有明 等[13]的研究显示，百令胶囊可以抑制TGF-β1和Collagen Ⅳ的表达，延缓肾脏的纤维化过程。马志敏 等[14]的研究显示，GSH可以抑制TGF-β1、Smad的表达，抑制大鼠的肺纤维化，本研究结果与之基本一致，提示百令胶囊联合GSH含药血清可能通过抑制TGF-β1/Smad的表达，抑制细胞外基质的分泌，抑制RIF的发生发展。

综上所述，百令胶囊联合GSH含药血清可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路，抑制细胞外基质的分泌，诱导细胞周期阻滞，抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞的过度增殖，为临床RIF的治疗提供选择依据，同时也为新药物靶点的研发提供了一定的理论依据。