基于比较基因组学的丁酸梭菌遗传多样性及生物学特性

易至，丁洁琼，王鸿超，陆文伟,2，赵建新,2，陈卫,2，张灏,2*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)2(国家功能食品工程技术研究中心，江苏 无锡，214122)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是健康人类和动物肠道菌群的重要组成部分，其分布广泛，由于能形成芽孢而具有较好的耐酸耐胆盐等特性，可长期滞留于环境中。一般认为丁酸梭菌是非致病菌，它可以维持肠道菌群平衡，此外还具有增强机体免疫力、抗癌等功能[1-2]。丁酸梭菌现已广泛用于动物养殖、水产和临床医药等领域[3-5]，一些菌株已被成功开发微生态制剂，用作人类和动物的益生菌[6-9]。鉴于丁酸梭菌众多的益生特性，丁酸梭菌的遗传多样性及其变化规律逐渐成为研究热点。

近年来，随着分子生物学技术和基因组测序技术的发展，采用比较基因组学等手段探究物种的遗传多样性逐渐成为研究重点。MO等[10]采用比较基因组学技术分析发现丁酸梭菌菌株DKU-01可代谢多种碳水化合物。BENAMAR等[11]使用全基因组测序和多间隔序列分型的方法分析了15株分离菌株和17株参考菌株，发现菌株之间存在高度变异性。此外，研究表示丁酸梭菌的许多益生作用归因于其代谢产物，最重要代谢产物便是丁酸，对人类肠道健康发挥着重要作用[12]。丁酸梭菌还能代谢淀粉酶和果胶酶等酶类，这些酶可以产生促进有益菌增殖的因子，有助于宿主对碳水化合物等营养物质的吸收和消化[13-14]。因此丁酸梭菌的益生作用与其糖代谢能力有密切关系。PRUDEN等[15]提出抗生素抗性基因是一种新型环境污染物，存在耐药基因转移的风险，若通过转移使致病菌获得耐药基因将带来更大的危害。并且在实际应用中，抗生素的大量使用已经导致一些耐药细菌的出现，所以用于开发微生态制剂的益生菌株的抗生素耐受性需要重视。此外，微生态制剂是否发挥作用关键在于是否能在人体内定植，而定植的必要条件是益生菌必须要有较高的胃液肠液耐受性，才能有效发挥其益生作用[16]。大量研究表明，丁酸梭菌菌株因可以形成芽孢而具有良好的胃肠道耐受性[17-18]。

本研究从150份健康人粪便样品中分离出9株丁酸梭菌，采用比较基因组学的手段对其基因组进行分析，并测定其生物学特性，包括同源基因和特有基因、系统进化关系、碳源利用能力、抗生素耐受性和耐酸耐胆盐能力。并通过基因层面结合表型实验结果，综合评估了丁酸梭菌的遗传多样性及生理特性多样性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和培养基

9株丁酸梭菌，分离于6份来自6个地区(黑龙江、新疆、四川、浙江、宁夏和上海)的健康人粪便，保藏于江南大学菌种保藏中心。

梭菌增殖培养基(reinforced clostridial medium，RCM)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉3 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，NaCl 5 g，无水乙酸钠3 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，刃天青4 mL(体积分数0.025%)，去离子水定容至1 L，pH值为6.8±0.1，115 ℃灭菌20 min。

1.1.2 实验试剂

菊粉、赤藓糖醇、甘露糖、纤维二糖、鼠李糖，上海生工公司；低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖，上海源叶生物科技有限公司；阿莫西林、红霉素、环丙沙星、甲氧苄氨嘧啶、卡那霉素、克林霉素、利福平、链霉素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、万古霉素、新霉素、胃蛋白酶，生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司；胆盐，英国Oxoid公司。所有试剂均为分析纯。

模拟胃液：称取定量胃蛋白酶溶于无菌生理盐水，调pH值为3，用0.22 μm无菌滤膜过滤后，使终质量浓度达到3 g/L；模拟肠液：称取定量胰蛋白酶和胆盐溶于无菌生理盐水，调pH值为8，用0.22 μm无菌滤膜过滤，使终质量浓度分别达到1和3 g/L。模拟胃肠液现配现用。

1.1.3 仪器与设备

超净工作台，江苏苏净集团有限公司；Whitley DG25厌氧工作站，英国Don Whitley Scientific公司； pH计，奥豪斯仪器(常州)有限公司；酶标仪，美国Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；UV1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养和DNA提取

9株丁酸梭菌在补充有0.5 g/LL-半胱氨酸盐酸盐的RCM培养基中，于厌氧条件下37 ℃培养菌株24～48 h，8 000 r/min离心5 min收集菌体。根据制造商的说明，使用TIANamp Bacteria DNA试剂盒提取基因组DNA。分别采用NanoDrop2000、picogreen和琼脂糖凝胶电泳检测方法对提取好的基因组DNA纯度、浓度和完整性进行质量评估，达到测序要求后上机测序。

1.2.2 基因组测序及比较基因组分析

采用二代测序Illumina HiSeq×10平台，对质检合格的DNA样品构建插入约400 bp的片段，进行PE150(pair-end)测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。利用短序列组装软件SOAPdenovo v2.0进行组装[19]，局部内间隙用GapCloser软件进行填充。使用Glimmer v3.02 预测基因组中的蛋白编码序列[20]。利用Orthomcl v2.0.9软件基于蛋白序列进行BLAST比对(保持50%一致性；截点参数 E-value<1e-4)，再用 Markov 聚类算法进行聚类[21]。利用MAFFT v7.3软件比对直系同源基因，提取聚类结果，利用邻接法并使用phyML v3.1软件构建系统发育树[22]。使用HMMER v3.1软件对菌株进行注释，获得碳水化合物活性酶基因注释结果并将其与碳水化合物活性酶(CAZy, http://www.cazy.org/)数据库进行比较[23]。与综合抗生素研究数据库(CARD 1.0.6, http://arpcard.Mcmaster.ca)进行比对分析，以获得基因组中预测的抗生素抗性基因信息[24]，若抗性基因的序列匹配度达到30%(E-value <1e-5)，则认为该抗性基因存在。使用HemI v1.0.0软件基于预测的基因绘制热图。

1.2.3 碳水利用能力测定

低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、赤藓糖醇、甘露糖、纤维二糖和鼠李糖过滤除菌后，添加到不含糖的RCM液体培养基中，使其终质量浓度为10 g/L。将待测试的菌株接种于含不同碳源的培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，酶标仪测定OD600，判定丁酸梭菌的碳源利用情况，若OD600值>0.3，则认为菌株可利用该碳源。以正常RCM培养基和不含糖的RCM培养基分别作为阳性和空白对照。

1.2.4 抗生素耐受能力测定

参照ISO标准ISO10932-2010，测定14种抗生素对丁酸梭菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，抗生素包括阿莫西林、红霉素、环丙沙星、甲氧苄氨嘧啶、卡那霉素、克林霉素、利福平、链霉素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、万古霉素和新霉素。

使用二倍稀释法按标准稀释抗生素。将倍比稀释后不同浓度的抗生素溶液分别加入无菌的96孔板中，第1孔为空白对照，加入无菌水和RCM培养基各100 μL；第2～11孔中按照浓度由低到高加抗生素稀释液各100 μL；第12孔为菌株生长阳性对照。将菌株活化后稀释至105～106CFU/mL，取100 μL菌悬液加入96孔板中，37 ℃厌氧培养48 h后，酶标仪测定OD625来判定菌株对抗生素的MIC值。菌株不出现生长的抗生素浓度即为该抗生素对菌株的MIC值。

1.2.5 产孢能力测定

将活化的菌株以2%的接种量接种于RCM培养基中，于40 ℃、210 r/min摇晃厌氧培养24～48 h以激发芽孢萌发。将菌悬液在85 ℃下水浴加热15 min，灭活营养细胞，得到芽孢悬液。热处理前后的悬液分别梯度稀释并倾注计数，根据营养细胞+芽孢总数、芽孢数量计算产孢率，如公式(1)所示。实验设3次平行。

(1)

1.2.6 耐酸耐胆盐能力测定

按照1.2.5的方法得到芽孢悬液，用无菌生理盐水洗涤2～3次后离心收集芽孢体，再重悬于无菌生理盐水。取1 mL芽孢悬液8 000 r/min离心10 min后弃上清，重悬于1 mL模拟胃液，置于37 ℃厌氧孵育2 h后计数。同样取1 mL芽孢悬液离心后，重悬于1 mL模拟肠液，置于37 ℃厌氧孵育4 h后计数。计算菌株存活率。实验设营养细胞对照，并设3次平行。

1.2.7 数据分析

所有测定指标均进行3次重复实验，所得数据用SPSS v20.0软件进行统计分析，独立样本t检验用于分析组间显著性差异，P<0.05被认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌基因组概况及系统发育分析

本研究从150份健康人粪便样品中分离得到9株丁酸梭菌。分别来源于6个地区，如表1所示，其中从FHLJZD47样品中筛得4株丁酸梭菌。分离菌株的基因组大小在4.46～4.65 Mb，基因组大小变异度较小；鸟嘌呤和胞嘧啶含量(guanine & cytosine，GC)在28.49%～28.54%。分离自同一样本的菌株基因组大小在4.48～4.65 Mb，GC含量在28.49%～28.54%。

表1 九株丁酸梭菌的来源信息及基因组概况Table 1 Source information and genomes of 9 Clostridium butyricum

基于全基因组序列比较分析丁酸梭菌的遗传多样性，包括9株实验室分离得到的菌株与25株NCBI数据库中已知的丁酸梭菌菌株(附表1，http://doi/org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023385)。如图1所示，同源性分析结果显示，34株丁酸梭菌共有346个同源基因，包括用于次生代谢产物的生物合成、氨基酸和碳水化合物转运、代谢等基因，以及大量未知功能的基因。每个菌株的特有基因个数为4～1 501个，特有基因个数占该菌株的总基因数为6%～29%，表明菌株之间存在明显差异。其中来自NCBI库中的菌株INCQS635、NEC8和DORA_1特有基因数量与其他菌株差别较大。本实验分离得到的9株丁酸梭菌的特有基因个数为24～109。其中FHLJZD47样品分离得到4株菌的总基因数在4 006～4 203，特有基因数在23～68，即同一样本分离的不同菌株基因组存在差异。

图1 丁酸梭菌的特有和同源基因Fig.1 Venn diagram displaying the unique and orthologues gene of Clostridium butyricum

基于单拷贝直系同源基因，对34株丁酸梭菌菌株和NCBI数据库中8株同属不同种的相似模式菌株进行系统进化分析，如图2所示。34株丁酸梭菌菌株成一亚簇，确定本研究所筛选菌株为丁酸梭菌。34株丁酸梭菌的进化与宿主来源没有明显相关性。根据本研究分离得到的9株菌的进化结果，可知菌株进化与地理来源之间也无明显相关性；该9株菌系统进化关系远近不同，表明菌株基因存在丰富的多样性。根据FHLJZD47T2、FHLJZD47T4、FHLJZD47T8和FHLJZD47T9这4株菌的系统发育结果，发现4株菌分成2个小分支，可知来自同一个样品里的菌株同源性高，但是也存在差异。BENAMAR等[11]通过系统发育分析，提出丁酸梭菌是一个在遗传上具有多样性的物种，这与本文研究结果一致。综上，根据丁酸梭菌菌株基因组大小、GC含量、特有基因以及系统进化等方面，表明丁酸梭菌存在菌株水平上的基因组多样性。

图2 丁酸梭菌基于同源基因的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on homologous genes of Clostridium butyricum注：蓝底：筛选菌株；红底：NCBI丁酸梭菌菌株；灰底：NCBI相似种菌株；紫圈：人类粪便；黄圈：动物粪便；绿圈：牛瘤胃；橙圈：窖泥、污泥、废水

2.2 丁酸梭菌碳源利用的特性

为了评估丁酸梭菌不同碳源利用能力，选取了8种不同碳源进行体外特性测定。结果如图3所示，所有测试菌株都能够利用甘露糖和纤维二糖，这结果与伯杰氏系统细菌学手册[25]的结论一致。除菌株FHLJZD47T6外，其他菌株均能利用低聚果糖;除菌株FZJHZD6M2外，其他菌株均不能利用菊粉、赤藓糖醇以及鼠李糖，可能是由于菌株的特异性。低聚木糖和低聚半乳糖的利用能力在所测试菌株中是可变的。同时该结果表明FHLJZD47样品中的菌株碳源利用能力存在差异，这与系统进化分析结果一致。根据其他研究结果可知[13]，丁酸梭菌对甘露糖、纤维二糖能利用，对鼠李糖不能利用，与本实验结果基本相符。

图3 丁酸梭菌对不同碳源的利用情况Fig.3 Utilization of different carbohydrates of Clostridium butyricum

为进一步验证丁酸梭菌碳源利用能力，我们基于碳水化合物活性酶库(carbohydrate-active enzyme,CAZY)对丁酸梭菌的碳水化合物活性酶基因进行预测(图4)，结果显示其碳水化合物活性酶基因包括39个糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)、13个糖苷转移酶(glycosyltransferase,GT)、9个碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases,CE)、8个碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)和2个多糖裂解酶(polysaccharide lyase,PL)家族，它们与甘露糖和纤维二糖等糖原利用相关。可见GH家族基因最多，其中GH13家族的基因最为丰富，基因个数在17～20个。GH13家族是淀粉酶等多糖利用相关基因。GH5家族可编码β-甘露聚糖酶基因，GH94家族可编码纤维二糖磷酸化酶基因，它们分别可以参与甘露糖和纤维二糖利用过程，与表型实验结果一致。除FZJHZD-6M2外，其他8株菌株均存在木糖苷酶基因，但是FXJWS2T9、FSHCM43T2和FNXYCHL33却不能利用低聚木糖。所有菌株均预测到β-半乳糖苷酶基因，而半乳糖是β-半乳糖苷酶代谢的底物之一，可是也存在3株菌不能利用。以上研究结果表明,个别菌株在基因层面和表型上存在差异，推测是因为编码木糖苷酶的基因不能转录表达。其次，未预测到与菊粉、赤藓糖醇和鼠李糖利用相关酶编码基因，这与表型实验结果一致性较高。

图4 丁酸梭菌GH家族基因的预测Fig.4 Prediction of GH family genes of Clostridium butyricum

2.3 丁酸梭菌对抗生素的耐受性

本研究测试了9株丁酸梭菌对14种抗生素的MIC值，并根据EFSA[26]对芽孢杆菌属抗生素耐受阈值的规定，将菌株划分为耐受(R)和不耐受(S)，结果如图5所示。这9株丁酸梭菌菌株普遍对氨基糖苷类抗生素(新霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素)耐受，半数菌株不耐受甲氧苄氨嘧啶，而绝大部分菌株都对阿莫西林、氨苄青霉素和四环素敏感，所有菌株对氯霉素、红霉素、环丙沙星、万古霉素、克林霉素和利福平敏感。ISA等[27]研究发现丁酸梭菌MIYAIRI 588和ATCC 19398T对卡那霉素、链霉素、庆大霉素等氨基糖苷类抗生素具有抗性，而对其他常用抗生素都特别敏感，这与本研究结果一致。同时，我们也发现FHLJZD47样品中的菌株对甲氧苄氨嘧啶的耐受性存在差异，证明同一样品中存在株水平的遗传多样性。

图5 丁酸梭菌对不同抗生素的耐受性Fig.5 Resistance of Clostridium butyricum to different antibiotics注：上端抗生素斜体表示EFSA还未制定该抗生素芽孢杆菌属耐受阈值

基于CARD数据库对菌株基因组进行注释，进一步探究丁酸梭菌抗生素基因型与表型的关系。如图6所示，如图6所示，9株丁酸梭菌菌株共预测到109种抗性基因，其中共有的抗性基因共63种，包括糖肽类抗性基因(vanWI，vanRI，vanRG，vanRF)、四环素抗性基因(tet35)、氟喹诺酮耐受基因(gyrA，mfd)、氨基糖苷类抗性基因(rpsL)、利福平耐受基因(rpoB、rpoC)、甲氧苄氨嘧啶抗性基因(dfrK)、林可酰胺类抗性基因(lmrC，lmrD)、β-内酰胺抗性基因(blaI，mecC，PBP1a)、大环内酯类抗性基因(macB)、氯霉素抗性基因(catB8)。可见在抗生素抗性基因层面，丁酸梭菌的抗性基因差异不大。

其中macB基因数量最多，它编码一种ABC转运蛋白，是一种抗生素外排泵，用于输出大环内脂类物质，与红霉素耐受相关。但是丁酸梭菌抗生素表型实验结果显示，丁酸梭菌对红霉素并不耐受，推测该抗性基因在丁酸梭菌中沉默，需后期进一步实验验证，亦或是由于macB基因与CARD数据库序列比对相似度不高(均<40%)。对于氨基糖苷类抗性基因rpsL基因在所有菌株中比对相似度均达到70%以上，该抗性基因可以使氨基糖苷类抗生素失活，由此证实了所测菌株对氨基糖苷类抗生素的普遍抗性。在FSHCM43T2菌株中blaI基因数大于其他菌株，表现出对氨苄青霉素和阿莫西林的抗性。研究表明[28]四环素耐药的重要机制是tet基因编码的活性药物外排的结果，我们发现在菌株FNXYCHL33和FSHCM43T2中tet抗性基因与CARD数据库序列比对结果的相似度可以达到97.0%，抗生素表型实验也发现这2株菌对四环素具有抗性。

但对于其他抗生素也存在菌株基因型与表型并不对应的情况，例如在菌株FNXYCHL33中注释到糖肽类抗性基因并且数量多，相似度最高达到52.6%，但表型显示出对万古霉素敏感，推测是由于基因、移动元件及其细菌宿主之间发生了复杂的相互作用[29]，阻碍了基因的表达。

图6 丁酸梭菌抗性基因的预测Fig.6 Prediction of Clostridium butyricum resistance genes

2.4 芽孢形成显著提高丁酸梭菌的耐酸和耐胆盐能力

为探究丁酸梭菌耐酸耐胆盐的能力，分别测定其营养体和芽孢体在模拟胃液和模拟肠液下的存活率。如表2、表3所示，9株丁酸梭菌的产孢率在34.72%～60.26%，但未能成功得到FSCDJY9T6、FSHCM43T2和FNXYCHL33这3株菌的芽孢体。通过比较营养体和芽孢体耐酸耐胆盐特性，结果表明，丁酸梭菌芽孢体模拟胃肠液的耐受性相较于营养体得到显著提升(P<0.05)，如菌株FXJWS2T9模拟胃液存活率从0.21%提升至9.04%，模拟肠液耐受性从1.18%提升至36.35%。丁酸梭菌芽孢体表现出对模拟胃液耐受性不强，但对模拟肠液的耐受性优于周非帆等[30]的实验结果。菌株产孢率与存活率相比较发现，芽孢不是菌株耐酸耐胆盐能力的绝对影响因素。推测还与细胞表层蛋白、胞外多糖产量以及分泌的胆盐水解酶相关[31]。

表2 丁酸梭菌营养体在模拟胃液和模拟肠液下的存活率 单位：%

3 结论

本研究从6份健康人粪便样品中分离出9株丁酸梭菌并完成了基因组测序，通过比较基因组学的方法，发现菌株在基因组大小、GC含量、特有基因数以及系统进化方面存在差异，表明丁酸梭菌在菌株水平存在基因组多样性；宿主来源和地理来源与系统进化没有显著相关性；菌株的碳水化合物酶活性基因数和抗生素抗性基因数呈现菌株特异性。

表3 丁酸梭菌芽孢体在模拟胃液和模拟肠液下的存活率 单位：%

注：-表示无实验数据

根据体外生物学特性实验结果，发现9株丁酸梭菌菌株普遍能利用甘露糖、纤维二糖和低聚果糖，但不能利用菊粉、赤藓糖醇和鼠李糖；菌株对氨基糖苷类抗生素耐受性高，对其他抗生素氯霉素、克林霉素和万古霉素等普遍不耐受，菌株FNXYCHL33和FSHCM43T2呈现出对四环素的抗性，可能与菌株携带tet抗性基因相关；所有菌株芽孢体耐酸性不强但耐胆盐能力较强，芽孢形成显著提高丁酸梭菌的耐酸和耐胆盐能力。与此同时，同一样品中的不同菌株生物学特性表型结果存在差异，验证了基因水平存在多样性的现象。此外，通过比较基因组学分析丁酸梭菌基因型，并结合生物学特性表型实验分析，发现菌株基因型和表型之间具有较高一致性，但存在部分菌株基因型与表型不匹配的情况。

附表1 NCBI丁酸梭菌和相似种的来源信息及基因组概况

注：“/”表示无样本信息