罗伊氏乳杆菌CCFM8631缓解小鼠非酒精性脂肪性肝病与其对肠道菌群及短链脂肪酸的调节显著相关

焦婷，朱慧越，司倩，许梦舒，孙姗姗，马方励，王刚*，赵建新，张灏，陈卫

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)2(无限极(中国)有限公司，广东 广州，510623)

在亚洲地区，随着人们生活方式和饮食结构的变化，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率逐年升高，由此演变的非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化以及肝癌的发病率也随之增加[1]。由于非酒精性脂肪性肝病的预后性较好，治疗NAFLD已成为预防恶性肝脏类疾病的重要措施。NAFLD的发病原因复杂，目前尚无明确完整的病理机制[2]。研究表明，NAFLD患者多具有明显的肝脏脂肪变性、血脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、肠道菌群紊乱等症状[3]。目前缓解NAFLD的方式主要为加强运动、降低能量摄入，尚无专门针对NAFLD的药物[2， 4]。

肠道菌群是肠道屏障中的重要成员，影响着宿主的营养吸收、能量代谢以及免疫应答[5]。在健康人群中，肠道菌群种类及数量繁多，作为优势菌群的Firmicutes与Bacteroidetes在肠道菌群结构中呈现相对稳定的比例，肠道菌群失调则使肠道菌群结构的稳定性和丰度有所降低，改变肠道菌群代谢产物，促进疾病的形成[6]。肝脏是外源化合物和微生物产物通过肠道后接触到的第一个可以产生免疫应答的器官，肠道菌群的结构以及肠道微生物产物的组成对肝脏代谢的正常运行有着非常重要的影响[7]。近年来，越来越多的研究表明，NAFLD的形成跟肠道菌群失调有着密切的联系[8]，因而调节肠道微生物已成为缓解NAFLD的重要方式。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)能够缓解高脂饮食诱导的NAFLD的疾病症状(高血脂、高血糖以及肝损伤症状等)[9]。目前的研究主要集中在分析菌株对NAFLD症状的影响，对于菌株缓解NAFLD途径尚无定论[10]。本文旨在研究LAB干预NAFLD后肠道中短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的变化、肠道菌群变化以及肠道内变化与NAFLD症状的相关性，以期发现菌株在肠道内缓解NAFLD的途径，为后期的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高脂高胆固醇饮食(high-gat and high-cholesterol diet，HFHCD)(能量为19.67 kJ/g，蛋白质、脂肪和碳水化合物所提供的能量分别占总能量的16%、42%和43%)，低脂低糖饲料(能量为16.74 kJ/g，其中蛋白质、脂肪和碳水化合物所提供的能量分别占总能量的20%、12%和68%)，南通特洛菲有限公司。色谱纯乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸，中国国药试剂公司；粪便DNA快速提取试剂盒，MP biomedicals有限公司；胶回收试剂盒，倍沃医学科技有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)检测试剂盒、总胆固醇(total cholestenone,TC)检测试剂盒以及蛋白定量试剂盒，南京建成生物技术公司；苏木精-伊红(hematoxylin,HE)染色液套装，南昌雨露实验器材有限公司；IL-6，IL-1β，TNF-α ELISA试剂盒，R&D有限公司；辛伐他汀片，美国默沙东有限公司；罗格列酮片，成都恒瑞制药有限公司；胰岛素检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司；植物乳杆菌L1(FSDJN73M1)、两歧双歧杆菌B1(FJSWX26M9)和罗伊氏乳杆菌CCFM8631,均来源于江南大学食品生物技术中心菌种保藏库。

1.2 仪器与设备

SX-300高温高压灭菌锅，日本Tomy公司；BC-5000 Vet全自动生化分析仪，深圳迈瑞医疗有限公司；气相色谱质谱联用仪、多功能酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；手动轮转式切片机，德国徕卡公司；数字切片扫描仪，匈牙利3DHISTCH公司；5804R高速冷冻离心机，德国艾本德公司；恒温恒湿培养箱，上海森信实验仪器有限公司；Illumina miseq pe300高通量测序仪，美国Illumina公司。

1.3 LAB悬浮液的制备

菌株的活化及扩培参照司倩等[11]的方法进行，菌体的收集与冻存参照朱广素等[12]的方法进行。临用前，加入9倍体积的无菌蒸馏水重悬菌株，即菌株浓度稀释为5.0×109CFU/mL。

1.4 动物实验设计

42只4周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠购买于上海斯莱克，饲养在SPF级12 h明暗交替的恒温恒湿环境中，温度为(23±3) ℃，湿度为(55±15)%。适应喂养1周后，按表1随机分成7组，每组各6只，并做相应处理23周。每周称体重、换水1次，饲料每2天换1次且称重。在23周时，收取小鼠粪便冻存于-80 ℃冰箱，禁食不禁水12 h后，称取小鼠体重，注射50 mg/(kg·bw) 10 g/L戊巴比妥钠溶液进行麻醉，采血取样。

表1 动物实验设计方案Table 1 The animal experiment design

注：3%蔗糖溶液为质量分数

1.5 血清中生化指标的测定

血清中的TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density liptein cholesterol，LDL-C)、谷丙转氨酶(alanine aminotrasferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、胆碱酯酶(cholinesterase，CHE)以及葡萄糖(glucose，GLU)水平用全自动生化分析仪测定。

1.6 肝脏中的细胞因子

肝脏中的白介素-1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)的含量用ELISA试剂盒测定，结果用蛋白水平进行校准。

1.7 肝脏组织病理分析

肝脏切片的制作及观察按前人所述操作[11]，肝脏评分采用SAF评分系统，根据BEDOSSA等[13]的方法进行。

1.8 结肠中的SCFAs分析

粪便中SCFAs的提取及分析操作参照WANG等[14]的方法进行。

1.9 肠道宏基因组

用MP biomedicals DNA快速提取试剂盒提取粪便中的DNA，16S rDNA测序及分析按照WANG等[15]的方法进行。

1.10 统计与绘图

所有实验数据采用SPSS进行单因素方差分析及相关性分析。采用Graphpad Prism6、TBtools作图。LEfSe分析在http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/上完成。所有实验结果均表示为Mean±SD。

2 结果与分析

2.1 CCFM8631的摄入减少NAFLD小鼠体重增量

肥胖是NAFLD的重要危险因素，一般表现为体重增量和白色脂肪指数增加。不同干预对NAFLD小鼠体重增量和白色脂肪指数的影响结果如图1所示。HFHC组的体重增量和白色脂肪指数显著高于NC组，与HFHC组相比，药物和LAB的干预均能显著降低HFHCD喂养小鼠的体重增量。此外，罗格列酮和CCFM8631的干预还能够显著缓解HFHCD诱导的白色脂肪指数上升。虽然L1和B1也能够显著减少小鼠的体重增量，但对白色脂肪指数的控制无显著效果。由此可知，罗格列酮和CCFM8631对肥胖的进程具有阻碍作用，与朱广素等的研究结果一致[16]。

a-体重增量；b-白色脂肪指数图1 不同干预对NAFLD小鼠体重水平的影响Fig.1 The effect of different treatment on body weight of NAFLD mice注：图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)

2.2 CCFM8631的摄入能够改善NAFLD小鼠的血脂代谢紊乱

不同组别的脂肪代谢水平如图2所示。与NC组相比，HFHCD喂养23周的小鼠血清中的TC、HDL-C和LDL-C水平均显著升高，血清TG水平无明显差异。HFHCD导致肝脏TC和TG水平显著升高。肝脏TG水平升高而血清TG水平保持稳定，提示模型小鼠脂肪肝的形成。与HFHC组相比，3株LAB均显著降低了肝脏中TC、TG的水平，但对血清中TC水平的影响并无统计学差异。这说明3株LAB均能有效地缓解小鼠肝脏中的脂质堆积，但可能由于血清中TC水平受饲料的即时影响更大，因此在血清TC指标上并无显著差异。但从HDL-C和LDL-C水平来看，尤其是LDL-C的水平的恢复，CCFM8631的干预表现出了非常显著的效果，L1和B1对血清LDL-C水平的影响并无显著性差异。结合血清TC水平的变化，虽然3株LAB对血清TC的影响相对HFHC组均无显著性差异，但从趋势上看，CCFM8631对血清TC水平的升高具有相对明显的缓解作用。这提示相比L1和B1，CCFM8631对HFHCD导致的TC水平的即时升高具有更为显著的减缓作用。可能正是由于CCFM8631的摄入使得小鼠血清中TC水平更快下降，机体产生的LDL-C水平才会相应的降低。以上结果表明，3株LAB均能够阻止小鼠肝脏的脂肪堆积，但CCFM8631可能更倾向于在更短的时间内降低血清中由HFHCD导致的高水平TC，可能跟罗伊氏乳杆菌菌株中的高活性胆盐水解酶有关[17]。高活性的胆盐水解酶有助于分解胃肠道中的结合态胆盐，将其转变成氨基酸和游离胆汁酸，游离胆汁酸能与TC共沉淀，以粪便的形式排出体外[18]。

a-血清TC；b-血清HDL-C；c-血清LDL-C；d-血清TG；e-肝脏TC；f-肝脏TG图2 不同干预对NAFLD小鼠脂肪代谢的影响Fig.2 The effect of different treatment on lipid metabolism of NAFLD mice

2.3 CCFM8631的摄入能够改善NAFLD小鼠的胰岛素抵抗

小鼠空腹血糖、胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数结果如图3所示。与NC组相比，HFHCD喂养23周的小鼠空腹血糖水平显著升高，胰岛素水平显著降低，胰岛素抵抗指数升高，表明HFHCD喂养23周造成了小鼠血糖代谢紊乱。罗格列酮和辛伐他汀的摄入均显著降低了小鼠的胰岛素抵抗指数，但对小鼠的空腹胰岛素水平没有表现出显著的恢复作用。此外，辛伐他汀还显著下调了小鼠的空腹血糖水平。3株LAB中，CCFM8631和B1显著恢复了小鼠的空腹胰岛素水平并降低了空腹血糖，但只有CCFM8631对胰岛素抵抗指数表现出了更为显著的降低作用。

a-空腹血糖；b-空腹胰岛素；c-胰岛素抵抗指数图3 不同干预对NAFLD小鼠胰岛素抵抗的影响Fig.3 The effect of different treatment on insulin resistance of NAFLD mice

2.4 CCFM8631的摄入能够缓解NAFLD小鼠的肝脏损伤

小鼠肝功能指标如图4所示。HFHCD喂养23周的小鼠肝脏指数显著增加，同时血清中ALT、AST和CHE水平显著升高。辛伐他汀显著降低了血清中ALT和AST水平，但对肝脏指数和CHE水平未表现出显著影响，罗格列酮表现出了强烈的肝损伤作用。罗格列酮的摄入导致ALT、AST以及肝脏指数的进一步升高。与罗格列酮和辛伐他汀不同，LAB的干预在肝脏损伤上表现出了显著的优势，尤其表现在AST水平的恢复上，3株LAB均表现出了显著的缓解效果。而在这3株LAB中，CCFM8631表现出了更好的预防HFHCD导致肝脏损伤的能力，具体表现在对肝脏指数以及ALT水平的恢复能力上。而L1和B1能够减缓肝脏线粒体的损伤，但对肝细胞损伤修复效果不明显。

同样，肝脏组织切片病理结果如图4所示，与NC组相比，HFHC组的肝脏细胞排列松散且不规则，其中肝脂滴将细胞核挤向一侧，形成大量中大型脂肪空泡，同时伴有少量炎性细胞浸润。另外，部分肝细胞发生了气球样病变。罗格列酮的干预促进肝脏进一步发生气球样病变，加重肝脏损伤程度。CCFM8631的干预改善了HFHCD喂养小鼠的肝脏病变程度，同时肝脏病理评分显著低于HFHC组。

a-肝脏指数；b-ALT；c-AST；d-CHE；e-病理切片；f-肝脏病理评分图4 不同干预对NAFLD小鼠肝脏损伤的影响Fig.4 The effect of different treatment on liver damage of NAFLD mice

2.5 CCFM8631的摄入降低NAFLD小鼠肝脏中炎症因子的水平

不同干预对NAFLD小鼠肝脏炎症水平的影响如图5所示，与NC组相比，HFHC组的肝脏中的TNF-α，IL-6和IL-1β水平显著增加。罗格列酮和辛伐他汀在TNF-α水平上表现出了下调作用。而3株LAB对TNF-α水平的影响比药物更显著。此外，CCFM8631还显著地缓解了IL-6和IL-1β水平的上升，而另外2株菌只有B1在IL-1β上表现出了显著的下调作用。

a-TNF-α；b-IL-6；c-IL-β图5 不同干预对肝脏中促炎因子的影响Fig.5 The effect of different treatment on lipid metabolism of NAFLD mice

2.6 CCFM8631的摄入提高NAFLD小鼠粪便中SCFAs水平

SCFAs是肠道中的微生物代谢人体未消化吸收的碳水化合物所产生的代谢产物。不同干预对NAFLD小鼠粪便中SCFAs含量的影响如图6所示。HFHCD喂养23周后，小鼠肠道中的丙酸和异丁酸水平显著降低，乙酸和丁酸水平无显著差异。与HFHC组相比，罗格列酮和辛伐他汀均无法恢复下降的SCFAs水平，甚至会进一步降低乙酸的水平。相反，3株LAB的干预均能显著提高4种SCFAs的浓度。据报道，口服乙酸盐能够抑制高脂饮食小鼠体重增加[19]；丙酸盐能抑制脂肪合成中的几种限速酶的转录以减少肝脏脂肪堆积[8]；丁酸盐能够促进线粒体功能增加能量消耗[20]，此外还能够促进肝脏GLP-1受体表达阻碍NAFLD的进程[19, 21]。3株LAB干预后，肠道中的SCFAs含量均有所提高，而对于NAFLD各症状的缓解效果表现却不一致。很明显，CCFM8631干预后，NAFLD小鼠的血脂血糖水平以及肝脏损伤程度均有所降低，体现出CCFM8631对NAFLD具有良好的缓解作用，而L1和B1并未表现出缓解作用，暗示除SCFAs以外，还存在着其他机制共同决定NAFLD的缓解。

a-丙酸；b-异丁酸；c-乙酸；d-丁酸图6 不同干预对NAFLD小鼠粪便中SCFAs含量的影响Fig.6 The effect of different treatment on fecal SCFAs of NAFLD mice

2.7 CCFM8631的摄入对NAFLD小鼠肠道菌群的影响

NAFLD的发生伴随着肠道菌群紊乱，在肠道菌群上的表现目前并无统一的结论，大多数研究表明高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肠道中Firmicutes的丰度上升，Bacteroidetes的丰度下降[22-23]。Firmicutes与Bacteroidetes是人体肠道中的优势菌群之一，肠道菌群中Firmicutes丰度的增加有利于能量的吸收更容易导致机体肥胖，Firmicutes与Bacteroidetes比值的上升与肥胖密切相关[23]。不同干预条件对NAFLD小鼠肠道菌群门水平改变如图7所示，与NC组相比，HFHC组的Firmicutes水平保持不变，但Bacteroidetes降低，即Firmicutes与Bacteroidetes的比值上升，Actinobacteria和Proteobacteria在肠道中的比例升高。罗格列酮和辛伐他汀进一步提高了Firmicutes与Bacteroidetes的比值，同时降低了Actinobacteria的丰度，另外罗格列酮的摄入反而进一步增加了Proteobacteria在肠道中的丰度。3株LAB的干预逆转了Firmicutes与Bacteroidetes的比值升高的现象，但对其他微生物在门水平上的改变呈现出不同的结果。其中CCFM8631和B1的干预增加了肠道中Bifidobacterium所在的Actinobacteria的丰度，降低了Proteobacteria的丰度，L1的干预对肠道中Actinobacteria和Proteobacteria的丰度无影响。Proteobacteria是肠道稳态失调的标志物之一，其丰度的升高通常与宿主的代谢紊乱、炎症反应有关[24]。

a-Firmicutes;b-Bacteroidetes;c-Firmicutes/Bacterpidetes比值；d-Atinbacteria;e-Proteobateria;f-各门水平所占比例图7 不同干预对门水平的影响Fig.7 The effect of different treatment on phylum level

如图8所示，通过LDA Effect Size(LEfSe)分析(LDA=2)发现， HFHCD喂养23周导致小鼠肠道菌群发生显著改变。如图9所示，与NC组相比，HFHCD显著增加了肠道菌群中的以下菌属的丰度，Mucispirillum、Turicibacter、Dorea以及Allobaculum，同时显著降低了Desulfovibrio的丰度。CCFM8631和B1的摄入显著提高了小鼠肠道中的Bifidobacterium、Lactobacillus的丰度，L1的摄入显著增加了小鼠肠道中的Akkermansia、Bacteroides以及Bilophila的丰度；另外，CCFM8631还显著提高了小鼠肠道中Desulfovibrio的比例。3株LAB降低了小鼠肠道中的Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的丰度。Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus以及Akkermansia对肠道菌群稳态具有促进作用，其丰度的增加在多种疾病的恢复中发挥着重要影响，越来越多研究表明这些菌能够在肠道内发挥有益的作用[25-26]。有研究表明，Turicibacter参与炎症反应[27]，糖尿病的减轻伴随着Turicibacter丰度的降低[28]。同样由于高脂饮食诱导的高血脂症，随着症状缓解也伴随着Turicibacter丰度的降低[29]。MASANORI等将糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠的肠道菌群对比后发现，SMB53在糖尿病小鼠的丰度远远高于正常小鼠[30]。另有研究表明，Allobaculum能够产生氧化三甲胺(TMAO)[31]，而TMAO能够通过抑制法尼醇X受体调节胆汁酸代谢促进NAFLD[32]，Allobaculum丰度的升高可能促进NAFLD[33]。这些结果进一步表明3株LAB的干预升高了部分有益菌的丰度，降低了NAFLD小鼠肠道中部分条件致病菌的比例，这可能是保护肝脏损伤的机理之一。

图8 基于LEfSe分析的肠道微生物菌群图Fig.8 Cladogram of gut microbiota based on LEfSe analysis

a-Bifidobacterium; b-Mucispirillum; c-Turicibacter; d-Clostridium; e-SMB53; f-Dorea; g-Allobaculum; h-Akkermansia; i-Bacterodes; j-Bilophila; k-Dasulfovibrio; l-Lactobacillus图9 不同干预对NAFLD小鼠肠道菌群属水平的影响Fig.9 The effect of different treatment on genus level

2.8 CCFM8631的摄入对NAFLD小鼠影响的相关性分析

为了进一步确定LAB对NAFLD实现干预的主要途径，我们将所有指标进行可视化处理，结果如图10所示，将肠道内的因素与NAFLD病理相关指标进行相关性分析，结果如表2所示，将肠道菌群中有差异的OTU与短链脂肪酸水平进行相关性分析，结果如表3所示。可视化结果显示，所有组分为了2个大簇，NC、CCFM8631、L1和B1组位于同一簇，而RC、SC和HFHC组则位于另一簇，表明菌株干预组结果和NC组具有相似性，且与药物干预组以及HFHC组具有差异。所有指标聚成了3个大簇，Turicibacter、Clostridium、SMB53和Allobaculum与肝脏病理主要指标(ALT、AST、肝脏TG和TNF-α等)聚集在同一大簇中，Clostridium同时与ALT、AST和肝脏指数聚集在一小簇，表明Turicibacter、Clostridium、SMB53、Allobaculum丰度的变化可能与肝脏病理形成相关。

图10 各指标可视化结果Fig.10 The visualization of indicators

相关性结果显示，4种SCFAs水平与肝脏TG、AST、CHE、TNF-α呈中度负相关性(r>0.4)。与已有的研究结论一致，表明4种SCFAs产量的提升可能通过减缓炎症进一步延缓NAFLD的进程。Bifidobacterium、Bacteroides和Bilophila与肝脏的TNF-α呈强负相关，Lactobacillus和Desulfovibrio与肝脏IL-6以及IL-1β水平呈中度负相关。有报道称，脂肪肝患者血清炎症因子与Bifidobacterium、Bacteroides和Lactobacillus呈负相关[34]，炎性疾病的缓解伴随着Bifidobacterium和Lactobacillus丰度的增加[35]，提示Bifidobacterium、Bacteroides、Bilophila、Lactobacillus和Desulfovibrio可能参与炎症反应的负调控。Turicibacter、SMB53以及Allobaculum与促炎因子TNF-α、IL-6以及IL-1β呈中度正相关，表明Turicibacter、SMB53以及Allobaculum可能参与炎症，与前人研究一致[27, 31]。肝硬化患者和NAFLD患者肠道菌群中Dorea丰度显著高于健康人群[36-37]，Turicibacter和Dorea与肝脏TG、CHE呈中度正相关性，提示Turicibacter和Dorea可能促进肝脏线粒体损伤，从而加重肝脏脂肪堆积。综上所述，小鼠肠道中Turicibacter、SMB53、Allobaculum和Dorea的丰度增加可能促进NAFLD的形成，Bifidobacterium、Bacteroides、Bilophila、Lactobacillus和Desulfovibrio的丰度增加可能阻碍NAFLD的形成，4种SCFAs水平的提高可能也是NAFLD缓解的因素之一。

表2 肠道内影响因素与NAFLD主要指标的相关性

注：*表示P≤0.05，**表示P≤0.01(下同)

表3 SCFAs与肠道菌群的相关性Table 3 Correlation between SCFAs and gut microbiota

肠道菌群中有差异的OTU与4种SCFAs的相关性结果显示，乙酸、丙酸和异丁酸与Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus以及Bilophila呈中度正相关，因而Bifidobacterium、Bacteroides以及Bilophila的丰度与这3种SCFAs的产量有关。Turicibacter、SMB53、Allobaculum以及Clostridium与4种SCFAs呈强负相关，提示Turicibacter、SMB53、Allobaculum以及Clostridium可能与4种SCFAs的含量减少有关。CCFM8631的摄入显著提高了肠道中4种SCFAs的含量，上调了Bifidobacterium、Lactobacillus和Desulfovibrio的丰度，降低了Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的丰度，因而CCFM8631缓解NAFLD可能与降低条件致病菌的丰度以及通过调节肠道菌群影响肠道内SCFAs的水平有关。然而L1和B1对NAFLD的缓解效果不佳，推测除以上调节方式外，CCFM8631可能还存在其他途径共同参与了NAFLD的缓解。

3 结论

本研究通过对HFHCD小鼠灌胃3株LAB(CCFM8631、L1和B1)探究LAB对NAFLD形成的影响。其中CCFM8631具有相对最为良好的缓解NAFLD的能力。此外，CCFM8631的摄入显著提高了肠道中4种SCFAs的含量，上调了Bifidobacterium、Lactobacillus和Desulfovibrio的丰度，降低了Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的丰度。对肠道内因素与病理指标进行相关性分析后发现，CCFM8631缓解NAFLD可能与降低条件致病菌的丰度以及通过调节肠道菌群影响肠道内SCFAs的水平有关。该研究为肠道菌群与NAFLD发生之间的关系提供参考，同时为实现膳食干预NAFLD提供依据。