浓香型酒醅微生物菌群演替规律及其空间异质性

胡晓龙，王康丽，余苗，田瑞杰，张治刚，王永亮，赵东，何培新，魏涛*

1(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州， 450000)2(河南仰韶酒业有限公司博士后创新实践基地，河南 三门峡, 472000) 3(贾湖酒业集团有限责任公司，河南 漯河, 462400)4(五粮液集团有限公司，四川 宜宾, 644000)

浓香型白酒作为我国优势传统发酵食品的典型代表，其生产工艺主要采用复杂且独特的开放、固态续糟、泥窖发酵模式，包括原辅料处理、续醅拌和、混蒸混烧、凉糟下曲、分层入池、多微共酵、长期贮存、精心勾调及成品包装等上百道工序[1-2]。泥窖内真核及原核微生物长期进行的物质和能量交换、转化是形成浓香型白酒呈香物质及独特风格的主要驱动力[3-4]。

酒醅作为微生物发酵的主要载体和白酒呈香物质的直接来源，其微生物群落多样性及其演替性一直是研究的热点[3-11]。目前，浓香型酒醅中优势微生物已明晰，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)及片球菌属(Pediococcus)等[5-8,12-13]，尤其是乳杆菌属。但不同层次酒醅的物料配比、与黄水和窖泥接触程度及发酵后期理化性质的差异造成了酒醅微生物群落存在空间异质性[3,9-11]。例如，赵东等[9]和吕辉等[10]研究(传统可培养技术)均发现上层酒醅细菌数量最多，下层酵母菌数量最多，且上述微生物数量均在发酵前期明显增加，后期急剧下降。李家民等[11]研究利用变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reation denaturing gradient gel electrophoresis)及克隆文库技术发现最下层酒醅(又称双轮底)的微生物种类最丰富，其次是中层，中层糟和面糟的细菌群落结构较为相似。然而，环境中仅有1%的微生物在实验条件下可培养[14]，PCR-DGGE仅能检测到优势微生物(>1%)[15]，克隆文库分析则依赖于PCR扩增产物的连接转化效率[16]，因此上述方法不能真实地反映出酒醅微生物群落多样性及组成。目前，高通量测序技术作为解析复杂微生物菌群的强有力手段[17]，能更可靠地定量估计微生物群落结构[18]。例如，肖辰等[7]采用高通量测序技术在泸型酒醅中检测到30个菌门涵盖397个属的细菌，并基于其组成差异将发酵过程划分为前(0～5 d)、中(6～17 d)和后期(18～40 d)3个阶段，且随着发酵时间延长Lactobacillus显著上升(P<0.05)并成为绝对优势菌(>70%)，而其他优势属呈先上升后显著下降的趋势，如Bacillus和瘤胃球菌属(Ruminococcus)。

尽管上述研究极大丰富了我们对四川等浓香型白酒主产区酒醅微生物群落多样性、演替规律的认识[5-11]，但是，基于高通量测序分析酒醅微生物群落空间(上层、中层和下层)异质性的研究鲜有报道。河南作为我国北方浓香型白酒主产区之一，其浓香型酒醅微生物群落演替规律及其在窖池上、中及下层分布的研究未见报道。此外，酒醅物料配比差异及其空间位置不同是造成其微生物群落α-及β-多样性在窖池中空间异质性主要因素，但空间位置的影响有多少尚不清晰。因此，本研究采用高通量测序技术，对河南产区贾湖酒业集团有限责任公司整个发酵过程中不同位置酒醅微生物群落α-及β-多样性解析，该酒厂入池时的上、中、下层酒醅物料配比完全一致，以期揭示由空间位置为主要因素造成的酒醅微生物群落多样性差异及其演替规律，为提升浓香型白酒生产工艺改进提供理论依据，同时有助于揭示我国浓香型白酒不同产区酒醅微生物群落的异同性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

2×Taq Master Mix、GoldView、D2000 DNA Ladder、6×DNA Loading Buffer，北京索莱宝科技有限公司；FastDNA®Spin Kit for Soil，美国MP公司。

C1000温度梯度PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；TGL-20M高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DYY-8C电泳仪，北京市六一仪器厂；Mixer4K微型涡旋混合仪，生工生物工程(上海)股份有限公司；WD-9403C紫外仪，北京六一生物科技有限公司；NanoDrop2000微量分光光度计，赛默飞世尔科技公司。

1.2 酒醅样品采集

酒醅样品均来自河南省贾湖酒业集团有限责任公司(E113°21′15″～113°44′53″，N33°7′50″～33°30′22″)。随机选取2口正常发酵窖池(3 m×2.5 m×1.8 m)，选定0(入窖时)、7、15、25、45和60 d(出窖时)6个具有代表性的发酵节点，参照WU等[19-20]描述的方法对每口窖池每个节点的上层(距窖顶0.5 m)、中层(距窖顶1.0 m)、下层(距窖底0.5 m)酒醅分别取样并充分混匀后作为该层酒醅的代表样品。因此，本研究共选取了2口窖池，每口窖池6个发酵节点，每个发酵节点的上、中、下层各选取1个代表样品，共计36个酒醅样品(样品编号见表1)，采样后迅速置于盛有干冰的取样箱中运输至实验室，并保存于-20 ℃冰箱中备用。

表1 酒醅样品编号Table 1 Sample numbers of fermented grains

1.3 样品DNA提取

酒醅样品的DNA提取采用FastDNA®Spin Kit for Soil试剂盒，具体的实验步骤参见说明书。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测提取后的DNA纯度和浓度。

1.4 PCR扩增及 Illumina Hiseq 测序

本研究采用细菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，扩增区域为16S rRNA基因V3～V4可变区。PCR扩增体系及条件参考文献[20]中描述的方法。后续测序文库构建及Illumina HiSeq 2500双端测序均委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.5 高通量数据处理

数据下机后进行质控，采用FLASH(version 1.2.11)[21]对原始数据进行拼接，并去除质量Q<20(Trimmomatic[22], version 0.33)、含有N碱基及嵌合体(UCHIME[23]，version 8.1)的序列，从而得到高质量的有效序列。然后将其进行聚类(USEARCH[24],version 10.0)，其中相似性≥97%的序列归为1个OTU，将OTU代表序列与Silva数据库[25]进行比对和物种注释。采用Mothur计算各样品群落α-多样性指数，包括Chao1、Shannon及Simpson指数。通过β-多样性分析比较不同酒醅样品的微生物群落组成，主要采用binary jaccard、 bray curtis、 (un)weighted unifrac多种算法获得相应距离下的样品，然后基于OTU信息进行层次聚类(UPGMA)树构建及PCA分析，基于优势属进行热图分析(heml软件)。

2 结果与分析

2.1 酒醅微生物群落的α-多样性分析

36个酒醅样品共获得2 880 869对双端序列， 经拼接和质控共得到2 702 161条有效序列，每个样品测序深度为74 294～76 298条。当测序深度超过20 000条时稀疏曲线进入平台期(图1)，表明本次测序深度(远>20 000条)可覆盖样本中绝大多数微生物种群信息，且发酵0～7 d酒醅样品中OTU数量高于发酵15～60 d的酒醅。此外，每个样品有效序列的覆盖率为99.9%～100%，表明基于有效序列的α-及β-多样性分析能较好地反映酒醅微生物群落信息。

图1 稀疏曲线Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community in fermented grains during fermentation

通过有效序列聚类、OTU划分及α-多样性分析可知，每个样品中OTU数量在75～212，Chao1指数在90.55～228.5，Simpson指数在0.05～0.83，Shannon指数在0.44～3.86。从原核微生物群落演替性来看(图2-a)，各层酒醅中OTU数量整体上变化规律一致，即呈上升(0～7 d，上层除外)、显著下降(7～15 d)(P<0.05)、稳定或缓慢上升(15～45 d)、随后下降(45～60 d)，但其数量在15～60 d的酒醅中无显著差异(P>0.05)。各层酒醅中Chao1指数整体上变化规律与OTU数量变化规律基本一致(图2-b)，且相同发酵节点下各层酒醅中Chao1指数的差异均不显著。各层酒醅中Shannon指数变化规律基本上是先显著下降(0～15 d)后稳定(15～60 d)，其中0和7 d的Shannon指数维持在较高水平且无显著差异(P>0.05)，Simpson指数变化规律与Shannon指数相反(图2-c、图2-d)。综上，随着发酵时间延长，3层酒醅的α-多样性指数变化规律基本一致，其中7、15和45 d是微生物α-多样性变化较大的发酵节点。整体上，各层次酒醅微生物多样性在发酵前期(0～7 d)均较高(Shannon指数为2.45～3.19)，随后明显或显著下降(7～15 d)，最后保持相对稳定(15～60 d，Shannon指数为0.56～1.08)；各层次酒醅微生物丰富度变化情况与多样性变化规律相似，但45 d之后各层酒醅微生物丰富度继续下降，60 d最低(Chao1指数为102.55～130.88)。这与王鹏等[12]、ZHANG等[26]和刘凡等[27]研究结果较为相似，这可能是由于发酵前期(0～7 d)各层酒醅含有从大曲带入的大量微生物，且酒醅营养丰富、具有一定的含氧量及酸度较适宜等宜于微生物生长繁殖，使得该阶段酒醅中微生物多样性及丰度均较高[8]。发酵7 d后各层次酒醅菌群多样性及丰度均开始下降，这可能是由于酒醅处于完全厌氧发酵状态，对好氧气微生物的生长产生了抑制作用，且醇、酸含量升高抑制了酒醅中大部分不耐酸细菌种群的生长[28]。

从空间分布分析(图2)，除0 d外，中层酒醅微生物Shannon指数在发酵过程中一直高于上层和下层酒醅，而OTU、Chao1指数及Simpson指数在不同层次酒醅样品间的高低顺序随发酵时间变化而变化且无明显规律，如0 d上层酒醅Chao1指数最大但60 d时最小。除15 d中层酒醅OTU数量显著高于其他2层酒醅，25 d上层酒醅Simpson指数显著高于中层酒醅，以及60 d中层酒醅Shannon指数显著高于其他2层酒醅外，同一发酵节点的3层酒醅之间的微生物α-多样性指数均没有显著差异(P<0.05)。综上，酒醅微生物群落α-多样性在本研究选取的窖池中基本上没有明显的空间异质性，与张大凤等[3]和李家民等[11]研究结果存在较大差异，这可能是由于四川的浓香型白酒生产所使用的窖池普遍较大且上甑时甑数较多，其糟醅的分层工艺十分精细，不同层次酒醅的物料(大曲、原料、酒醅及辅料等)配比有所不同[2]，因而上、中、下层糟醅的理化结构等差异较大，进而导致入池的各层次酒醅理化性质(如酸度及营养等)存在较大差异，而本研究所取浓香型白酒企业发酵窖池内上、中、下层酒醅具有相同的物料配比，不同层次酒醅理化性质差异较小。因此，推测窖池各层次酒醅的物料配比是影响其微生物群落空间异质性的主要因素。

a-OTUs；b-Chao1指数；c-Simpson指数；d-Shannon指数图2 酒醅发酵过程中OTU、Chao1、Simpson及Shannon多样性指数分析Fig.2 Analysis of diversity index of OTU, Chao1, Simpson and Shannon during the fermentation process注：a,b,c代表同一层酒醅在不同天数间存在显著性差异(P<0.05)；A,B代表相同天数酒醅在不同层次间存在显著性差异(P<0.05)

2.2 酒醅发酵过程中微生物群落β-多样性分析

2.2.1 门水平上的微生物群落结构分析

在所有酒醅样品中共检测到9个门(图3)，包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、Epsilonbacteraeota、螺旋体门(Spirochaetes)及酸杆菌门(Acidobacteria)，其中前5个门为酒醅优势菌门(每个样品中含量>1%)，在每个样品中总含量达到99.60%～99.99%。这与之前诸多报道一致，表明酒醅的共性特征(如高醇、高酸)是上述菌门富集的主要因素。

图3 各层酒醅发酵过程中门水平上的菌群结构Fig.3 Bacterial structure at phylum level of fermented grains at different locations during fermentation

以时间轴分析，随着发酵时间延长，各层次酒醅优势菌门的数量均在发酵0～7 d最多(4～5个门)，随后(7～15 d)显著减少至1～3门并稳定至发酵结束(表2)。以Firmicutes和Proteobacteria为例，Firmicutes含量呈先上升随后稳定的趋势(表3)，从0 d的41.3%(各层含量平均值)明显或显著上升至7 d的70.7%，15 d后升至98%以上并稳定至发酵结束；而Proteobacteria呈下降趋势，由0 d的46.3%逐渐下降为7 d的20.7%，15 d时降至最低(0.8%)并稳定至发酵结束，表明发酵过程中Firmicutes呈急剧上升趋势且成为发酵后的唯一优势菌门，而其他优势菌门逐渐下降且发酵后期(15～60 d)很低(<1%)，与ZHANG等[6]、WANG等[13]和LI等[29]的报道一致。其中7和15 d是整个发酵过程中微生物组成变化的主要发酵节点，与上述α-多样性研究结果吻合。

空间上，发酵前15 d上层和中层酒醅中优势菌门数量高于下层，15 d后中层优势菌门数量基本上高于其他2层。同一发酵节点下，各层酒醅优势菌门(纲/属)数量无显著差异(P>0.05，表2)。在整个发酵过程中，中层酒醅Firmicutes含量低于其他2层，而Proteobacteria高于其他2层，尤其是发酵前期(0～7 d)；发酵7 d时，中层的Actinobacteria、Bacteroidetes 和Cyanobacteria含量均高于其他2层。但是，除0 d各层次酒醅中Actinobacteria和Cyanobacteria的含量，以及15和60 d各层次酒醅中Bacteroidetes含量存在显著差异外，同一发酵节点各层次酒醅优势菌门的含量几乎均无显著差异(P>0.05)，表明各层次酒醅原核微生物组成基本上没有明显的空间异质性，与上述α-多样性研究结果吻合。

注：将每个样品中含量>1%的门、纲和属定义为相应分类水平下的优势微生物；每行不同小写字母代表样品间存在显著性差异(P<0.05)(下同)

表3 门水平下优势微生物的平均相对丰度 单位：%

注：每列不同大写字母代表该菌门在同一发酵时间节点下不同层次酒醅中的含量存在显著差异(P<0.05)

2.2.2 属水平上的微生物群落结构分析

在属水平上，所有酒醅样品中共检测到124个属，通过Venn分析进一步比较酒醅微生物菌群的演替性和空间异质性(图4)。时间轴上，不同发酵节点酒醅样品微生物属及共有属的数量均在发酵第7天(123和119个)后明显减少并基本稳定至发酵结束(60 d)，其中60 d酒醅属数量最少(101和53个)，这与OTU分析结果一致(图2-a)，这主要是由于普遍在发酵后期酒醅的酸度会呈现增加趋势且营养成分随之减少等[3-4,12,30]，进而导致大量微生物被淘汰。空间上，从7 d起，各层特有属数量基本呈增加趋势(45 d下层除外，L45)，尤其是下层酒醅，反映了不同层酒醅理化性质在发酵后期存在差异，如重力作用导致下层含水量、黄水、酸、醇等含量高于其他2层[30]。从各层特有属及共有属的含量来看，不同发酵节点的各层酒醅共有属的相对含量平均值约为99.9%，而各层特有属总含量均很低(<0.07%)，表明各层酒醅共有属一直为整个发酵过程中的主导微生物。特有属含量虽少，但其是否对每层酒醅产香或微生态平衡等具有特定功能或贡献尚不明晰，需进一步研究。

a-0 d；b-7 d；c-15 d；d-25 d；e-45 d；f-60 d图4 每个发酵节点中不同位置酒醅菌群属水平Venn图Fig.4 Venn diagram of microbial flora at genus level of fermented grains at different locations in each fermentation time注：U、M、L分别代表上、中、下层；0,7,15,25,45,60分别代表发酵时间，d

将每个样品中含量≥1%的属定义为优势属并将其用于热图分析，共发现28个优势属，分别隶属于7个纲(图5)，其在每个样品中的总含量为85.54%～99.87%。其中乳杆菌属(Lactobacillus)、Kosakonia、大肠杆菌志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、醋杆菌属(Acetobacter)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)及片球菌属(Pediococcus)在所有样品中的平均相对含量>1%，与四川地区酒醅的优势菌基本一致[6-7,24-26]，同时存在一定差异，如Kosakonia和Escherichia-Shigella。

图5 各层酒醅样品中优势属变化热图Fig.5 Heat map of dominant genera in fermented grains at different locations注：标注下划线的属为7 d各层次酒醅中存在差异的属

时间轴上，绝大多数优势属含量在发酵7 d后明显下降为非优势菌，而乳杆菌属(Lactobacillus)明显上升并成为发酵15～60 d酒醅的绝对优势菌(98%)，且几乎是唯一优势菌(表2、图5)，与之前诸多报道一致[6-7,12-13,26-27]。空间上，相同发酵节点下，不同层次酒醅微生物(属水平)含量存在差异，而这种空间差异主要发生在发酵前7 d(图5)，例如，发酵7 d时约有18个属(图5标注下划线的属)的含量在各层次酒醅之间存在差异。明晰酒醅中微生物群落的演替性及空间异质性能为白酒风味物质溯源及揭示其形成规律提供较强的理论指导。以乳酸为例，其为白酒中良好的呈味物质，有助于增加白酒厚重感及降低白酒刺激感[8]，根据本研究的结果可以初步推测乳酸形成的主要微生物为乳杆菌属(Lactobacillus)且主要在发酵后期形成，这也与其他文献[6-7,12-13,26-27]报道的基本一致，同时，乳酸也主要在后期合成[28]。

2.3 酒醅微生物群落聚类分析

UPGMA层次聚类分析结果表明36个酒醅样品大致聚为3簇(图6-a)，其中第I簇(12个样品)包含了全部的0和7 d酒醅，第Ⅱ簇(9个)包含了全部的15 d酒醅及3个25和45 d的酒醅，第Ⅲ簇(15个)全部为25～60 d的酒醅。表明酒醅微生物群落组成与发酵时间存在较好的关联性，可将整个发酵周期划分为发酵前期(0～7 d)、中期(7～15 d)和后期(15～60 d)3个阶段，与肖辰等[8]研究结果基本一致。PCA分析(图6-b)再次表明了所有酒醅样品可以根据其发酵时间聚类，即0、7和15～60 d的酒醅样品能较好地聚成3类。综上，发酵时间为7和15 d是反映整个发酵过程中微生物群落β-多样性动态变化的主要时间节点，与前面α-多样性及群落组成分析结果一致。此外，各层次酒醅入窖时(0 d)微生物群落组成空间差异较小(图6-b)，随着发酵时间的延长，相同发酵节点的各层酒醅不能很好地聚在一起(图6-a，如7 d上层JP7和JP8之间)或距离逐渐增大(图6-b，如7 d上层酒醅U7)，反映了其发酵快慢程度出现了差异[29]。这种发酵速度差异对微生物群落组成造成的影响可能要强于空间位置，如发酵7、15 d上、中、下层酒醅不能有效地分别聚类，而不同层次间的酒醅相似度反而更高(图6-b)，这可能是由于酒醅的均质性偏差，如酒醅与其他物料拌匀程度无法完全一致及每个位置固、液、气三相状态的差异等因素，但具体原因需要更深入的研究。

a-UPGMA树图；b-PCA分析图图6 不同时间及各层酒醅间微生物群落β-多样性的UPGMA树和PCA分析图Fig.6 UPGMA tree and PCA analysis of β - diversity of microbial community among fermented grains at different times and locations

3 结论

本研究基于高通量测序技术分析了贾湖酒业集团有限责任公司酒醅微生物菌群演替规律及空间分布。所有酒醅样品共检测到9个门、14个纲、124个属，其中Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Cyanobacteria为酒醅优势菌门；在属水平，乳杆菌属是发酵15 d之后的酒醅中的绝对优势微生物。基于酒醅微生物群落组成可将整个发酵过程分为发酵前期(0～7 d)、中期(7～15 d)、后期(15～60 d)，其中发酵前期酒醅微生物物种多样性及丰富度均显著高于发酵后期。不同层次酒醅微生物群落α-和β-多样性变化规律相似，且同一发酵节点的各层次酒醅微生物群落α-多样性及门水平组成存在差异，但大多差异不显著，这可能与本研究所取窖池中各层酒醅入池时的物料配比一致有关。发酵中、后期，每层特有优势属的数量较多，但含量均很低。相同时间节点下各层酒醅聚类没有明显规律，即不同层酒醅微生物群落组成相似度要高于同层酒醅之间，表明不同层次酒醅发酵程度快慢对酒醅微生物群落差异造成的影响可能要强于空间位置，但造成酒醅发酵程度快慢的因素尚不明晰，需要进一步探究。此外，本研究仅从DNA水平揭示了不具有活性的微生物菌群结构差异，后续需要进一步结合转录组学及代谢组学等方法深入分析不同位置活性微生物结构差异。