顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用结合多元统计法分析不同品种温州蜜柑汁的香气成分

周琦，易鑫，欧阳祝，李贵节,2，朱霞建，范佳莹，李则灵，谈安群，黄林华，王华*

1(西南大学柑桔研究所，中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712) 2(重庆市功能性食品协同创新中心，重庆第二师范学院，重庆，400067)

柑橘是我国种植面积和产量均居第一的水果，其产量高达4 138.14万t(2018年)，按种类可主要分为宽皮柑橘、橙、柚、柠檬及其他柑橘五大类。宽皮柑橘是一类果皮宽松，易剥皮、汁多肉粒饱满的柑橘品种。2017年我国宽皮柑橘产量达1818.77万t，占当年总柑橘产量的47.7%，属产量最高的柑橘品种。宽皮柑橘在我国品种多样，资源丰富，主要栽培品种有温州蜜柑、椪柑和南丰蜜桔，其产量分别占我国柑橘总产量(2017年)的23.4%、10.3%及6%[1]。

温州蜜柑又名无核蜜橘、温州柑等，主产于日本、韩国、浙江、广西、湖南、湖北等区域，果实9月中下旬成熟，具有高糖低酸、无核、皮薄等许多优良特点，产量占宽皮柑橘总产量的70%左右[2]。我国温州蜜柑品系诸多，大多从日本引进，少数为自己选育而成。成传香等[3]通过研究3种中国主栽宽皮柑橘制汁品质，结果表明，相比于南丰蜜桔与椪柑温州蜜柑不论是色泽、总酚含量还是香气物质总量均表现出独特的优势，是我国最适合制汁用的主栽宽皮柑橘品种；金润楠等[4]则通过对浙江、湖南和湖北3个产区的宫川和尾张温州蜜柑的香气成分进行分析，结果显示，不同产区的相同品种具有其产区特有味道，且甜香味为宫川品种的特殊成分。香气是影响柑橘加工制品品质最重要的因素之一[5-6]，且受不同因素的影响，已有研究虽表明不同品种的宽皮柑橘汁的香气成分是存在差异性[7]，但对温州蜜柑香气成分与其品种的研究较少，且有关温州蜜柑品种的数量的研究也较少。

温州蜜柑虽然是我国产量最大的宽皮柑橘品种，但主要以鲜销为主，深加工以桔瓣罐头为主，制汁占比较小[8]，远低于其他汁用柑橘品种。本研究以18种的主栽温州蜜柑为对象，模拟工业中橙汁的生产对温州蜜柑进行制汁，利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法结合主成分分析探究其香气成分的差异性，从而进一步对温州蜜柑汁用提供数据支撑以提高我国宽皮柑橘利用率，解决鲜果滞销难题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

成熟的温州蜜柑果实均采自中国农业科学院/西南大学柑桔研究所国家果树种植柑橘资源圃(东经 106°43′、北纬29°83′)，样品信息见表1。

表1 柑橘样品信息Table 1 The information of citrus samples

1.1.2 试剂与耗材

环己酮(>99.5%,色谱纯)，aladdin公司；甲醇、C5～C25正构烷烃均为色谱纯，美国Honeywell公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890 GC-5977 MSD，配备30 m×0.25 mm，0.25 μm的DB-5MS石英毛细管色谱柱)，美国Agilent公司； H-100-DWBWIA01原汁机，惠人新生活文化传媒有限公司；固相微萃取装置(85 μm，CAR/PDMS)，美国Supelco公司; 50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头(DVB/CAR/PDMS)，美国Supelco公司；SQP十万分之一天平，赛多利斯科学仪器有限公司； FiveEasy Plus pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PAL-1型手持糖度计，日本ATAGO公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料处理及样品制备

NFC果汁制备：采摘新鲜成熟的果实，去皮榨汁，经过100目纱网精滤，装瓶备用。

样品的前处理：取5 mL摇匀后的果汁于 20 mL螺口萃取瓶中，加入配制好的内标物3 μL(环己酮采用甲醇稀释40倍)，充氮20 s，40 ℃平衡 20 min后插入SPME萃取头于萃取瓶中，并置于40 ℃萃取30 min，样品在平衡和萃取过程中用磁力搅拌器以240 r/min轻轻涡旋，于250 ℃上机解析 5 min。

柑橘汁模拟汁配制：参考DREHER的方法[9]并做修改：配制100.0 g糖溶液，含6.0 g蔗糖、3.0 g果糖和3.0 g葡萄糖，柠檬酸1.0 g，其余用水补足；再加入VC使其质量浓度为500.0 mg/L，得到模拟柑橘汁[pH 3.5、(11±0.5)°Brix]。

1.3.2 实验条件

GC-MS升温程序：起始温度35 ℃，保持0 min；再以7 ℃/min 升至98 ℃；接着以3 ℃/min升至161 ℃，最后以10 ℃/min升至241 ℃；进样口温度230 ℃，不分流进样；载气(He)流速1.2 mL/min。

EI离子源；电子能量70 eV; 传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z为40～350。

1.3.3 样品挥发性有机物的定性与定量分析

定性分析：各挥发性成分采用安捷伦系统图谱库(W10N14.L)匹配、保留指数及利用模拟柑橘汁配备部分标准品三者相结合进行准确定性。

保留指数线性升温公式如公式(1)所示[10]：

(1)

式中：t0为待测物质的保留时间；tn+1和tn分别表示碳原子数为n+1和n的正构烷烃的保留时间，且式中tn+1>t0>tn

定量分析： 参考SHUI等[11]定量方法稍作修改，以环己酮为内标物，采用内标法半定量。

各样品挥发性有机物含量计算如公式(2)所示[12]：

(2)

式中：C待,待测物质的质量浓度，μg/mL；S待,待测物质的峰面积；ρ,环己酮的密度,即0.95 mg/μL；V1,样品中加入环己酮的体积；S1,环己酮的峰面积；V待,样品的体积。

1.4 数据分析处理

数据分析软件采用The Unscrambler X 10.4和Qualitative Workflows B.08.00；数据处理采用Microsoft Excel 365；图片处理采用Origin 2018；所有样品平行实验3次，结果以平均数±标准差显示。

PCA分析步骤：以挥发性有机物(volatile organic compound，VOCs)种类为行，待测样品种类为列，插入数据；通过analyze- Principal Component Analysis，选取Maximum components为4，进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 温州蜜柑汁气相色谱图流出特性

本实验采取HS-SPME-GC-MS测定了18种不同成熟期温州蜜柑汁中香气成分的种类及含量，定性方式采用保留指数[13]结合质谱，部分色谱峰结合标准品定性；其中保留指数值相差均在千分之五以内，质谱库匹配度均高于91%，确保了结果的准确性。样品温州蜜柑汁共测出60种VOCs，以2003-4和宁红73-19温州蜜柑为例，典型的温州蜜柑汁VOCs的总离子流图如图1所示。由图1可知，温州蜜柑色谱图的物质流出除去0～6 min和30～38 min(此时间段只有极少物质流出且浓度极低)，大致可以分为以下几个阶段(图中已标注)：阶段1(RT：8.2～11.5，RI：927～1 062)主要是单萜类化合物以及少量低碳醇醛流出，包含了几乎占自身总离子响应80%以上的D-柠檬烯；阶段2(RT：11.6～18.4，RI：1 069～1 277)主要是醇类、醛酮类及少量单萜类化合物流出；阶段3(RT：19.5～22.1，RI：1308～1376)主要是酯类物质的流出；阶段4(RT：22.6～29.1，RI：1 390～1 562)主要是倍半萜类物质和其他碳原子数较大的化合物的流出。

图1 典型温州蜜柑汁的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of typical satsuma juice

2.2 不同品种温州蜜柑汁香气物质种类及含量的比较

柑橘汁的香气是由单萜类、倍半萜类、醛类、酮类、醇类、酯类等多种VOCs混合后的综合表现，且不同种类的香气成分贡献的作用不同[14]。18种温州蜜柑经SPME富集后进行测定，其中单萜类化合物12种(包含D-柠檬烯)，倍半萜类化合物19种，醛类化合物8种，醇类化合物10种，酮类和酯类化合物种类最少，均为4种；此外，还有3种其他化合物被检出，合计60种。

由表2可知，在所有的温州蜜柑样品中，单萜类和倍半萜类化合物无论是数量还是含量在所有的香气成分中均是最高的，这与冯桂蓉[15]的研究结果相类似；除去D-柠檬烯后，单萜类化合物占总体香气成分的比例可以达到58%～88%，总萜类化合物可以占80%以上。2003-4温州蜜柑(Ⅱ)的单萜和倍半萜类化合物的含量远高于其他品种，分别达655.7 μg/mL和90.45 μg/mL，但是萜类化合物的检出数量与其他样品几乎相同，原因是巴伦西亚橘烯、β-月桂烯和γ-松油烯的含量较高，分别为69.71、164.60和367.58 μg/mL；此外，醇类和酯类化合物的种类和含量在所有样品中也是最高的，分别达45.93 μg/mL(9种)和31.18 μg/mL(4种)，这也导致了其挥发性有机物的种类也是所有样品中数量最多的，为42种。宁红73-19(XVI)、大分1号(Ⅰ)和寿太郎(XVII)的醛类化合物在所有样品中含量较高，分别达57.94、32.30 和30.16 μg/mL，原因是宁红73-19(XVI)中的壬醛(29.73 μg/mL)、大分1号(Ⅰ)和寿太郎(XVII)中的正己醛(分别为17.97 μg/mL和17.98 μg/mL)含量较高，但是这3种温州蜜柑的醛类化合物数量与其余品种相差无异，均为5种。所有样品中酮类化合物和其他成分化合物总体含量和数量上相近。

对比18种温州蜜柑香气成分种类及含量，发现温州蜜柑汁中醛类香气物质主要是正己醛、正辛醛、壬醛和癸醛；醇类香气物质主要是叶醇、芳樟醇、4-萜烯醇和α-松油醇；酮类香气物质主要是甲基庚烯酮和香叶基丙酮；1,3,8-p-薄荷三烯、对伞花烃和百里酚只在少数几个温州蜜柑样品中检出。此外，酯类化合物作为主要的1类香气贡献成分，在所有温州蜜柑样品中检出量仅为4种，且绝大多数温州蜜柑仅含有一种(橙花乙酸酯)或不含有，这也导致了温州蜜柑汁的香气成分普遍低于甜橙汁，此结果与已有研究相类似[16]。

2.3 不同品种温州蜜柑汁特征香气成分的比较

柑橘汁中含量高的香气物质其香气强度不一定高，对总体香气的贡献也并不高，如几乎在所有柑橘品种中均存在的物质D-柠檬烯；通常将分析得到的香气物质的含量与其香气阈值相比，比值被称为香气活力值(odor activity value, OAV)。一般OVA值>1则该香气被认为对总体香气有贡献，被称为特征香气成分或主体香气成分，且OAV值越高，该香气物质的强度就越大，对总体香气的贡献也就越大[17]。通过HS-SPME-GC-MS对样品香气物质的定量结果并结合查阅文献[5,18-22]及书籍[23]找到的各物质香气阈值，计算出各香气的OVA值，表3即为18种温州蜜柑汁中OAV值>1的香气物质及其香气活度值。

表2 18个品种温州蜜柑汁挥发性有机物分类汇总表Table 2 Classification summary table of volatile organic compounds in 18 kinds of satsuma juice

注：a：样品编号对应表1中的样品名称；表中数据未包括D-柠檬烯；括号里的数字表示香气物质的数量；实验重复3次，结果采用平均数表示，保留小数点后两位数，单位为μg/mL；ND表示未检出

由表3可以看出，18种温州蜜柑汁中特征香气成分总共29种，其中单萜类9种、倍半萜类2种、醛类7种、醇类5种、酯类1种、酮类3种、其他成分2种。在所有特征香气物质中，α-蒎烯、β-月桂烯、α-萜品烯、β-顺式罗勒烯、γ-松油烯、α-萜品油烯、正己醛、壬醛、芳樟醇的OAV值较高，且在所有柑橘汁样品中均能检出，其中大多数柑橘汁样品的γ-松油烯、正己醛、壬醛和芳樟醇的OAV值>100，可认为这些香气成分对温州蜜柑汁总体香气起一定的调节作用，这也与FENG等[24]的研究结果相对应。

此外，别罗勒烯只在2003-4温州蜜柑(Ⅱ)中检出；2-已烯醛和L-香芹酮只在大分1号温州蜜柑(Ⅰ)和寿太郎温州蜜柑(XVII)中检出；十二醛只在宁红73-19温州蜜柑(XVI)中检出；紫苏醛和香茅醇只在大分1号温州蜜柑(Ⅰ)中检出；百里酚只在寿太郎温州蜜柑(XVII)中检出，可认为这些香气物质是某几种温州蜜柑特有的成分；而巴伦西亚橘烯和4-萜烯醇虽在所有温州蜜柑汁样品中检出，但是只有在2003-4温州蜜柑(Ⅱ)中OAV值较高，可认为其他品种的温州蜜柑中巴伦西亚橘烯和4-萜烯醇的含量要低于2003-4温州蜜柑(Ⅱ)，同时2003-4温州蜜柑(Ⅱ)中橙花乙酸酯的OAV也明显高于检出品种。

表3 18种温州蜜柑汁的特征香气物质及香气活度值Table 3 characteristic aromatic substances and odor activity value of 18 kinds of satsuma juice

注：表中第一行的罗马数字对应表1中的样品编号；b表示该香气物质在油中的阈值，未标注则是在水中的阈值；该表中剔除了D-柠檬烯；结果采用平均数表示，保留小数点后一位数；ND表示未检出

2.4 主成分分析

为进一步从整体上反应不同品种温州蜜柑香气成分构的差异，剔除了大部分样品未检出的特征香气(如别罗勒烯、2-已烯醛和紫苏醛等)，以18种温州蜜柑样品为分析对象，采用主成分分析对21种主体香气成分进行分析，结果如图2和图3所示。由二维分值图(图2-A)可见温州蜜柑汁样品点分别汇聚，4个集合间差异明显，其中2003-4温州蜜柑(Ⅱ)和宁红73-19温州蜜柑(XVI)自成一个集合，与其余样品间距明显，另外2个集合中各成熟期的样品均包含在内；由相关性载荷图(图2-B)可知，葵醛、α-松油醇、4-萜烯醇、橙花乙酸酯、巴伦西亚橘烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、水芹烯、α-萜品烯、β-顺式罗勒烯、γ-松油烯、α-萜品油烯在在PC-1上的相关度分量达到了0.8～1.0，而α-金合欢烯、壬醛、正辛醛在PC-2上的相关性分量达到了0.6～0.8，即这2组VOCs分别在X+和Y-方向上有较大贡献，且在X+上作较大贡献的多为单萜类物质；酮类物质虽在PC-2上的相关性分量仅达到0.5～0.6，但其只对Y-方向作贡献；此外，对X+和Y-方向上起着共同较大贡献的物质是醇类物质(芳樟醇和叶醇)，对X+和Y-方向起一定贡献的是橙花乙酸酯和巴伦西亚橘烯，这也与图2-A中温州蜜柑汁样品点的分布相吻合。由上述结果可知，特征香气成分在不同种类的温州蜜柑中分布具有特征性，可利用主成分分析进行放大区分，且温州蜜柑的成熟期并不直接影响其特征香气成分。由图3可知，Hotelling’s T2检验仅有1个离群点，远小于样品数，且均未在较大误差区(HotT2>15.96，FRes>1.76)出现；同时4组主成分对解释方差和验证方差的贡献度分别达到了99.8%和97.3%，解释方差与验证方差基本接近；上述结果表明模型能够很好地反映原始样本的特征。

A-样品分值图；B-香气成分的相关载荷图图2 温州蜜柑汁主成分分值图Fig.2 Score plotting of principal components analysis in satsuma juice注：图1-A中圆形代表特早熟品种、正方形代表早熟品种、菱形代表中熟品种、三角形代表晚熟品种，图中罗马数字与表1中样品编号相对应;图1-B中不同种类的香气物质采用不同的形状标注，中文名与之对应

A-检验结果；B-主成分累计可释方差图3 温州蜜柑汁样品Hotelling’s T2检验结果及主成分累积可释方差Fig.3 Hotelling's T test results and cumulative interpretable variance of the principal components of satsuma juice samples

3 结论

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法对18种温州蜜柑汁进行测定，共检测出58种香气成分，其中有29种为特征香气(OAV>1)，别罗勒烯、2-已烯醛、L-香芹酮、十二醛、紫苏醛、茅醇和百里酚为品种特征性成分；此外，温州蜜柑样品在主成分分值图空间分布上具有特征性，分布特征性受品种影响而与成熟期无直接关系，可利用主成分分析进行放大区分。同时，2003-4温州蜜柑和宁红73-19温州蜜柑香气种类量与含量较其他品种更佳。

综上，本研究通过HS-SPME-GC-MS结合主成分分析比较了不同品种温州蜜柑汁的香气成分含量、特征香气的差异，初步明确了各特征香气对温州蜜柑汁总体香气品质的贡献程度，选出了2种香气品质较佳的品种；基于此，后续的研究可利用GC-O/MS结合感官评定设计香气重组及缺失实验对特征香气成分进行验证，并进一步分析各品种温州蜜柑的特征香气物质的差异对总体香气的影响。