大鼠头皮组织形态和生物力学参数的增龄性变化*

李明杰，王杰，夏冰，刘芳，李曼，李竹，王志荣，曹亚芬，汪家文*，万昌武*

(贵州医科大学 法医学院，贵州 贵阳 550004)

头皮是覆盖于头部的组织器官,由毛发、血管、神经、胶原纤维和弹性纤维等构成，具有多种生理功能，其中如黏弹性、张力和抗压力等功能的实现有赖于自身的生物力学特性[1]。头皮虽由多种成分构成，但胶原纤维是其主要的力学元素，抗张力强。头皮被外力拉伸直至拉断，其应变力经历由低到高的过程，其力学特征的改变主要取决于胶原纤维，随着胶原纤维的老化，头皮的生物力学特性必然发生变化[2]。有文献报道，不同年龄人群颅脑组织的材料属性和力学参数存在差异[3-5]，但是关于不同年龄人群头皮生物力学参数方面的文献较少，头皮组织形态变化和生物力学参数的增龄性变化规律有待进一步研究。本研究选取大鼠为研究对象，检测不同年龄大鼠头皮组织的厚度等形态学参数，采用电子万能材料试验机检测头皮的极限载荷(ultimate load，UL)、拉伸强度(tensile strength，TS)及弹性模量(elastic modulus, EM)等生物力学参数，探讨大鼠头皮形态学参数及其生物力学参数的增龄性变化规律，为利用头皮进行法医学年龄推断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠48只，由贵州医科大学实验动物中心提供[合格证号SCXK(黔)2018-0001]，按出生周数分为2、4、6、8、17、26、52和104周龄组，每组6只。本研究经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准(编号1901050)，实验严格按照动物伦理要求进行。

1.2 方法

1.2.1头皮试件制作 各组大鼠按每100 g大鼠体质量予10%水合氯醛溶液0.5～1.0 mL的剂量腹腔注射麻醉，分离大鼠头皮并于大鼠头顶正中纵向剪取4.0 cm×1.0 cm和4.0 cm×0.5 cm头皮试件A、B两块，见图1。

图1 大鼠头皮试样Fig.1 Rat scalp samples

1.2.2头皮组织学观察 取B块头皮组织置于10 %中性甲醛溶液中固定72 h，包埋，RM2016型轮转切片机(德国徕卡仪器公司)常规石蜡切片、HE染色，光学显微镜(日本Olympus公司)下观察头皮的组织学变化。利用Image Pro-Plus 6.0图像分析软件对头皮表皮、真皮、皮下组织的厚度和总厚度进行检测，垂直于皮肤表面进行3次线性测量，取其平均值为各层的厚度值[6]。

1.2.3头皮生物力学试验 取A块头皮组织放于生理盐水内备用(因2周龄组大鼠头皮较小，故顺延取其颈、背部皮肤)，利用测厚规(0-10*30型，浙江义乌市开拓五金有限公司)测量每份头皮试样两端及中部3个位置厚度，取其平均值为试样厚度。使用KDII-0.2 电子万能材料试验机(深圳市凯强利试验仪器有限公司)上、下夹具夹持头皮试件两端各1 cm，保持自然平直，标距=20 mm(图2)，为防止头皮滑脱，在夹具内面衬垫一层粗砂布。预调3次达到稳定状态后，采用纵向单轴拉伸法进行拉伸试验。加载参数设置：试验速度(V)=5 mm/min，预加载力0.5 N，停机条件为后一个力值小于前一个力值的7/10(F2<0.7 F1)。实验结束后计算机自动计算输出极限载荷、拉伸强度和弹性模量等参数。

图2 头皮单向纵轴拉伸试验示意图Fig.2 Schematic diagram of scalp uniaxial tensile test

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 头皮组织增龄性变化

2.1.1各组大鼠头皮组织学变化 如图3所示，在2～26周内，不同年龄组大鼠头皮随年龄增长逐渐增厚。26周后，大鼠头皮变化幅度减小，厚度趋于稳定；17周龄组大鼠头皮角质层脱落，表皮其余各层结构清晰与真皮连接紧密；大鼠头皮真皮内见大量胶原纤维、血管、汗腺、皮脂腺、毛囊以及神经末梢，横纹肌结构清楚。2周龄组大鼠头皮真皮层胶原纤维最细、最少、排列疏松，在17周后胶原纤维粗大、致密、之后趋于稳定(图4)。各周龄大鼠的皮下组织主要由疏松结缔组织构成。

2.1.2头皮厚度 随年龄增长，大鼠头皮总厚度、表皮、真皮和皮下组织逐渐增厚，头皮总厚度和真皮层厚度26周时达高峰，之后趋于稳定；表皮与真皮比值变化不明显(P>0.05)。各组大鼠头皮表皮、真皮、皮下组织厚度及头皮总厚度差异均有统计学意义(F值分别为39.433、180.797、125.69及322.731，P<0.05)，均与年龄呈正相关(r>0,P<0.05)，但表皮与真皮的比值与年龄无相关关系(r=0.100,P>0.05)。见表1。

注：A为2周，B为4周，C为6周，D为8周，E为17周，F为26周，G为52周，H为104周。图3 各组大鼠头皮的组织学变化(HE，×100)Fig.3 Histological changes in rats' scalp of different age groups (HE，×100)

注：A为2周，B为4周，C为6周，D为8周，E为17周，F为26周，G为52周，H为104周。图4 各组大鼠头皮的真皮层变化(HE，×400)Fig.4 Histological changes in rats' scalp of different age groups (HE，×400)

表1 各组大鼠头皮厚度的变化Tab.1 Changes in histological thickness in rats' scalp of different age

注：(1)与2周组比较，P<0.05；(2)与4周组比较，P<0.05；(3)与6周组比较，P<0.05；(4)与8周组比较，P<0.05；(5)与17周组比较，P<0.05；(6)与26周组比较，P<0.05；(7)与52周组比较，P<0.05。

2.2 头皮拉伸实验力-变形曲线变化

初始阶段，头皮组织的拉伸力随位移增大而逐渐增大，当拉伸力达到最大值(60.97 N)后则急剧减小，最终试件断裂。见图5。

图5 各组大鼠头皮组织的拉伸力-变形曲线Fig.5 Force-deformation curves in rats' scalp in different age groups

2.3 头皮生物力学参数变化

各组大鼠头皮极限载荷、拉伸强度和弹性模量组间差异均有统计学意义(F值分别为24.980、11.052、5.578，P<0.05)。随着年龄增长，极限载荷和拉伸强度呈增大趋势，与年龄呈正相关(r分别为0.694、0.548，P<0.05)；弹性模量无明显变化趋势，与年龄无相关关系(r=0.290，P>0.05)。见表2。

3 讨论

头皮主要由角质化的表皮、富含胶原纤维的真皮以及由疏松结缔组织为主要成分的皮下组织组成[7-8]。研究发现，皮肤的机械行为取决于多种因素，如年龄、性别、病理和体重，以及部位的位置(异质性)和方向(各向异性)，其中年龄是重要的影响因素[9]。已有研究表明，皮肤形态具有明显的增龄性变化特征[10-12]。正是这种特征，为利用头皮进行年龄推断提供了可能。

表2 各组大鼠头皮生物力学参数的变化Tab.2 Changes in biomechanical parameters in rats' scalp of different age groups

注：(1)与2周组比较，P<0.05；(2)与4周组比较，P<0.05；(3)与6周组比较，P<0.05；(4)与8周组比较，P<0.05。

本研究发现，随年龄增加头皮总厚度、表皮、真皮和皮下组织层厚度均具有增厚趋势，且与年龄呈正相关关系，表明上述参数均可用于进行法医学年龄推断。其中，26周前变化趋势更为明显，26周后趋于稳定，由于大鼠26周相当于人类35岁[13-14]，故利用头皮形态学参数进行年龄推断的“窗口期”为0～35岁。本研究还发现，头皮增厚以真皮层增厚为主，提示头皮总厚度和真皮层厚度在年龄推断中具有优势。

利用头发、眼角膜等组织生物力学参数进行年龄推断已有相关文献报道[15-16]，但利用头皮生物力学参数推断年龄较为少见。通常在利用纵向单轴拉伸试验测试软组织时，需要对试件进行预调以获得可重复的机械响应，即在试验开始时多次加载-卸载试件，以达到生物力学性能稳态，通常在预调3～10次之后达到可重复性状态[17]。Tonge等[18]研究了人类皮肤组织的最小预处理效应，即预调处理对数据有微小程度的影响。在实验初始阶段，低载荷会使皮肤发生很大变形，因为此时皮肤仍然非常柔顺，纤维松弛，随着纤维排列重新定向并逐渐沿载荷施加方向排列，皮肤的拉伸力逐渐增加，而随着试验进行，大多数纤维在载荷方向排列和拉伸，曲线几乎变成直线。当拉伸力进一步增大达到纤维极限时，再施加很小的力就会导致皮肤破裂或断裂[19]。因此，本研究以预调3次后进行试验，以保证结果的可重复性和可靠性。

拉伸试验发现，大鼠头皮的极限载荷、拉伸强度、弹性模量等生物力学参数在2～104周总体呈上升趋势，极限载荷和拉伸强度与大鼠周龄呈正相关关系，与Ottenio等[20]研究结论相符，提示极限载荷、拉伸强度与年龄具有较好的拟合度，可用于年龄推断。但是，大鼠头皮的弹性模量参数与年龄无明显相关性，可能与头皮弹性纤维随年龄增长呈现非直线型变化趋势有关，故该参数可能不适用于年龄推断[21-22]。本研究单轴拉伸试验结果同时表明，极限载荷、拉伸强度参数的增龄性变化趋势范围比头皮总厚度、真皮层厚度等参数的范围更广，可弥补头皮厚度在大鼠26周后出现“平台期”现象的不足。因此，利用生物力学参数进行年龄推断方法更优。

综上所述，不同年龄大鼠头皮组织总厚度、真皮和皮下组织厚度随年龄增长逐渐增大，头皮极限载荷、拉伸强度随年龄增长逐渐增大，上述参数呈现的增龄性变化规律可用以法医学年龄推断，其中以极限载荷、拉伸强度参数更为实用。